欢迎来到雪梨的复现妙妙屋~诺奖吃瓜虽精彩，生信基础别掉队。今天菠萝作为暂代主持人，介绍一篇研究非肿瘤疾病关键基因和免疫浸润的文章（IF=5.7）复现方法，大家也可以自主思考一下，诺贝尔奖热点——机器学习、蛋白质分子结构预测等方法怎样应用到我们自己的文章中。有任何问题欢迎留言，或添加雪球老师直接询问~
分析工具不会用？
初学代码总卡顿？
服务器带不动高通量数据分析？
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全文共10图2表，我们今天先来学习前5张图的复现。
Key genes and immune infiltration in chronic spontaneous urticaria: a study of bioinformatics and systems biology
慢性自发性荨麻疹的关键基因和免疫浸润：生物信息学和系统生物学研究
期刊：Frontiers in Immunology
IF：5.7
发布时间：2023/11/15
套路：非肿瘤
数据来源：GSE57178，GSE72540数据集
技术路线：
从GEO数据库下载GSE57178 和 GSE72540数据集→对GSE52093 和 GSE72540数据集进行差异分析，通过火山图形式可视化分析结果→利用STRING数据库构建差异基因的PPI网络图→绘制差异基因热图→GSEA富集分析→利用David数据库和Metascape数据库对差异基因进行生物过程富集分析→利用Funrich、软件对差异基因进行生物途径富集分析→利用Cytoscape软件的Mcode插件生成基因模块并进行通路富集分析→利用Cytoscape软件的cytoHubba插件筛选hub基因并进行互作网络分析→对两个数据集进行免疫浸润分析→对hub基因进行免疫浸润相关性分析探究hub基因与免疫细胞的相关性
分析工具：
仙桃学术（https://www.xiantaozi.com/）（新版）各种生信分析工具
GEO数据库（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）
GEO数据集下载
STRING数据库（https://string-db.org/）
构建PPI网络
CytoScape软件及其插件
PPI网络可视化及各种分析
NetworkAnalyst数据库(https://www.networkanalyst.ca/NetworlKAnalyst/)
疾病关联和药物互作分析
David数据库(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)
生物过程富集分析
Metascape数据库(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)
生物过程富集分析
FunRich软件(下载：http://www.funrich.org/)
生物途径富集分析
Figure 1 差异表达基因分析
Figure 2 差异基因热图
Figure 3 GSEA富集分析
Figure 4 DAVID和Metascape富集分析
Figure 5 Funrich富集分析
复现流程
*友情提示：
请及时保存分析结果并合理命名文件！
Figure 1
差异表达基因分析
Figure 1A
*包含使用仙桃进行缺失值过滤和数据去重的逐步教学
在GEO数据库中下载GSE57178数据集的表达矩阵。
新建一个excel命名为【GSE57178】，提取出表达矩阵。
在GEO数据库中通过GEO2R获取探针的Symbol ID。
新建一个excel命名为【ID1】，提取出“ID”列和“Gene.symbol”列。
对【GSE57178】按第一列“ID_REF”升序进行排序，对【ID1】也按第一列“ID”升序进行排序，然后将【ID1】中“Gene.symbol”列替换【GSE57178】中“ID_REF”列，完成探针合并。将列名“Gene.symbol”改成“Symbol”，并另存为一个excel命名为【exp1_pre】。
进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【其他】中选择我们需要用到的【缺失值过滤】。
上传【exp1_pre】，点击【验证】。“过滤类型”选择“过滤掉特定缺失及以上个数”，“特定个数”填“1”，然后点击【确认】。
点击【数据缺失值过滤结果.csv】下载过滤结果。
进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【其他】中选择我们需要用到的【数据去重】。
上传【数据缺失值过滤结果】，点击【验证】。然后点击【确认】。
点击【数据去重.csv】下载去重结果，并重新命名为【exp1】，即为GSE57178数据集表达谱。
在GEO数据库中提取GSE57178数据集的分组信息，保存到一个新的excel【group】中。
进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【差异表达】中选择我们需要用到的【芯片数据-差异分析】。
上传表达谱和分组信息，点击【验证】。“参考组选择”选择“HC”，点击【确认】。
在【历史记录】中点击【差异分析.xlsx】，下载差异分析结果。
新建一个excel命名为【火山图】，将【差异分析】中的“id”，“logFC”和“P.Value”列复制到【火山图】中，并将“P.Value”改为“pvalue”。
进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【差异表达】中选择我们需要用到的【火山图】。
上传火山图数据，点击【验证】。
修改【主要参数】，点击【确认】。
出图后可以根据需要保存相应格式的文件(如pdf、tiff等)。
在【差异分析】中按照|“logFC”列|>1，“P.Value”列<0.05，筛选差异表达基因，并将筛选到的差异基因复制到一个新的excel【sig1】中，列名为“GSE57178”。
Figure 1B复现步骤与Figure 1A类似，将数据集GSE57178替换成数据集GSE72540即可，完成后也可以得到【sig2】用做后续分析。
Figure 1C
新建一个excel命名为【韦恩图】，将【sig1】中的“GSE57178”列和【sig2】中的“GSE72540”列复制到【韦恩图】中并保存。
进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【基础绘图】中选择我们需要用到的【韦恩图】。
上传韦恩图数据，点击【验证】，然后点击【确认】。
出图后可以根据需要保存相应格式的文件(如pdf、tiff等)。
点击【交集情况.xlsx】下载交集基因。
Figure 1D
在STRING数据库(https://cn.string-db.org/)网站中选择Multiple proteins，输入所有的交集基因，然后点击
【SEARCH】。
点击【CONTINUE】。
使用默认参数，点击【Exports】，下载第四个.tsv格式的数据。
新建一个excel命名为【updown】，第一列为交集基因，第二列为基因的上下调情况。
打开Cytoscape软件，选择“Import Network from File System”，上传刚才下载的数据，点击【OK】。
选择“Import Table from File”，上传交集基因的上下调分组数据，点击【OK】。
点击【Tools】-【Analyze Network】-【OK】。
点击【Style】，“Fill Color”选择“group”，“shape”选择“圆形”，“Size”选择“TopologicalCoefficient”，点击“Lock node width and height”，根据需要调整样式。
调整好之后选择【Exportas Image】保存为.png或其他格式。
Figure 2
差异基因热图
Figure 2A
进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【其他】中选择我们需要用到的【数据提取】。
上传GSE57178表达谱数据，点击【验证】。“类型”选择“下面特定变量”，将交集基因复制到“特定变量”框中，点击【确认】。
点击【提取数据.csv】下载提取结果。
在第一行添加一行分组，行名为#group，然后另存为一个新的csv文件命名为【GSE57178热图】。
进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【表达差异】中选择我们需要用到的【简易数值热图】。
上传热图数据，点击【验证】。
修改【主要参数】，然后点击【确认】。
出图后可以根据需要保存相应格式的文件(如pdf、tiff等)。
Figure 2B复现步骤与Figure 2A类似，将数据集GSE57178替换成数据集GSE72540即可。
Figure 3
GSEA富集分析
Figure 3A
将之前得到的GSE57178【差异分析】中“id”列和“logFC”列复制到一个新的excel【GSE57178GSEA】中，并将“logFC”改为“value”。
进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【功能聚类】中选择我们需要用到的【[GSEA] 富集分析】。
上传GSE57178数据，点击【验证】。“基因集”选择“Hallmarks”基因集，点击【确认】。
在【历史记录】中，点击【GSEA.xlsx】下载GSEA富集分析结果。
进入仙桃网站，选择【生信工具】，在左侧的【功能聚类】中选择我们需要用到的【[GSEA] 经典可视化】。
自动上传了刚刚GSEA富集分析的结果，在“ID列表”输入想要展示的通路名称，然后点击【确认】。
出图后可以根据需要保存相应格式的文件(如pdf、tiff等)。
Figure 2B复现步骤与Figure 2A类似，将数据集GSE57178替换成数据集GSE72540即可。
Figure 4
DAVID和Metascape富集分析
Figure 4A
在David数据库(https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp)网站中输入所有的交集基因，选择“OFFICIAL_GENE_SYMBOL”和“Homo sapiens”，选择“Gene List”，最后点击【Submit List】进行富集分析。
点击【Gene_Ontology (3 selected)】，然后点击【Chart】下载BP富集分析结果。
点击【Download File】下载分析结果并保存到一个新的excel【David_bp】中。
将第二列“Term”分列，得到“BP”列，并且添加两个新的列“-LOG10(Pvalue)”和“P=0.05 reference”。“-LOG10(Pvalue)”列的值为对“PValue”列取负对数，“P=0.05 reference”列的值为-log10(0.05)。
选中“BP”，“Count”，“-LOG10(Pvalue)”和“P=0.05 reference”列前10行数据，点击【二维柱形图】。
生成图表以后，右击图表，点击【更改图表类型】。点击【组合图】，根据需求调整图表类型，然后点击【确定】。
出图后将标题改为“Biological Processes (BP)”，然后可以根据需要保存相应格式的文件(如png、tiff等)。
Figure 4B
在Metascape(https://metascape.org/gp/index.html#/main/step1)网站中，输入所有的交集基因，点击【Submit】。“Input as species”选择“H. sapiens”，然后点击“Custom Analysis”。
点击【Enrichment】，选择“GO Biological Processes”，然后点击【Enrichment Analysis】。
出图后可以根据需要保存相应格式的文件(如pdf等)。
Figure 5
Funrich富集分析
在FunRich官网（http://www.funrich.org/）下载FunRich软件。
点击【Add dataset】。
输入所有交集基因，然后点击【OK】。
点击【Gene enrichment】-【Analysis】。
使用默认的数据集，点击【OK】。
点击【Save Chart】保存图片。
恭喜你完成前半部分复现！在后半部分中，我们会继续学习差异基因的通路富集分析、Hub基因互作网络分析，以及免疫浸润分析的操作。想要学习全文完整复现，记得点击星标，每日更新不错过！
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