Alzheimers Dement：抑制线粒体DNA转录翻译可改变AD相关生物学

导读：

     阿尔茨海默病 (AD) 的特征在于线粒体结构和功能的变化。然而，线粒体病理学在其他AD特征的时序和背景中的地位仍然存在争议。近期Alexander P. Gabrielli团队在《Alzheimers Dement》杂志发表题为“Inhibiting mtDNA transcript translation alters Alzheimer's disease-associated biology”的研究论文。作者团队通过使用氯霉素（一种抑制线粒体DNA产生的转录翻译的抗生素）处理SH-SY5Y细胞及诱导多能干细胞（iPSC）衍生的神经元，成功建立了一个研究模型，以探讨线粒体功能障碍对AD相关基因和蛋白质的影响。研究发现，SH-SY5Y细胞和iPSC神经元通过增加线粒体DNA拷贝数和转录来应对线粒体DNA转录翻译的抑制，核表达的呼吸链mRNA和蛋白质水平也随之改变。结果表明，原发性线粒体功能障碍可能通过诱导补偿性细胞器反应、改变核基因表达，进而改变AD相关的基因与蛋白质生物学，这也可能重现大脑衰老与AD的分子现象，为进一步探索AD病理机制提供了重要依据。

     为了抑制mtDNA表达转录本的翻译，作者团队将人SH-SY5Y细胞暴露于氯霉素，这是一种专门抑制原核生物核糖体功能的抗生素，并持续处理7天。实验结果显示，所采用的剂量和处理时间参数并未降低细胞活力（图1A）。为了验证靶标的参与，研究团队对两种由mtDNA编码的蛋白质MT-CO2和MT-ND3的状态进行了评估。与未处理的细胞相比，氯霉素处理显著减少了这两种蛋白质的量（图1B）。此外，还对线粒体在翻译抑制下的直接适应反应及其后果进行了筛查。研究发现，氯霉素处理显著增加了SH-SY5Y细胞的mtDNA拷贝数（mtDNAcn）、MT-CO2 mRNA和MT-ND3 mRNA（图1C-E）。在基础条件下，与未处理对照细胞相比，氯霉素处理细胞消耗的氧气更少，并对寡霉素的ATP合酶抑制和与FCCP的解偶联反应减弱，同时糖酵解通量升高，表现为ECAR增加（图1F，G）。COX Vmax测定表明细胞色素c氧化速率降低了约85%（图1H），而柠檬酸合酶（CS）Vmax率未见显著变化（图1I）。

图1 氯霉素抑制SH-SY5Yρ+细胞mtDNA转录翻译，诱导线粒体DNA拷贝数和转录的代偿性变化，改变生物能量通量和酶功能。

     研究团队还探讨了氯霉素对SH-SY5Y细胞中核编码的线粒体相关基因和蛋白质的影响。结果显示，氯霉素处理降低了COX4呼吸链亚基蛋白的含量，但COX4 mRNA水平保持不变（图2A、B）。此外，呼吸链亚基NDUFB8的蛋白质和mRNA水平均有所下降（图2C、D），而线粒体外膜蛋白VDAC1的蛋白水平未见显著变化（图2E）。研究还发现，PPARGC1A基因的mRNA量显著增加，该基因编码的转录共激活因子在促进线粒体生物发生中具有重要作用（图2F）。此外，COX10 mRNA也显著增加，该mRNA编码一种参与线粒体血红素A的生物合成及COX全酶组装的酶。这些结果表明，氯霉素处理对核编码线粒体基因的表达和调控具有复杂影响。

图2 氯霉素对SH-SY5Yρ+细胞核编码、线粒体相关基因和蛋白质的影响

研究显示，氯霉素处理影响了apoE/APOE、APP和tau的相关生物学特征。具体而言，APOE mRNA的水平增加了260%（图3A）。虽然APP蛋白的总量增加了18%，但APP mRNA水平并未改变（图3B、C）。在SH-SY5Y细胞的蛋白裂解物中，全长APP在蛋白质印迹上表现为两个条带，可能反映了不同的剪接亚型或糖基化形式（图3C）。在这种情况下，下带的增加主导了整体的增幅，而上带的密度相较于对照细胞略有减少（图3C，D）。使用ELISA试剂盒测定分泌至培养基中的Aβ42蛋白含量，但由于本实验方案下未特异性浓缩Aβ42蛋白，信号低于检测限（数据未显示）。此外，BACE1蛋白水平（参与APP淀粉样蛋白生成的加工）未见显著变化（图3E）。尽管MAPT mRNA水平有所下降，但总tau蛋白水平保持稳定；然而，GSK-3β的ser9磷酸化量（一种增加其磷酸化tau能力的翻译后修饰）增加了30%（图3F-H）。在评估tau丝氨酸404的磷酸化水平时，并未检测到明显条带（数据未显示）。此外，SNCA mRNA水平无显著变化（图3H）。尝试通过western blot检测α-突触核蛋白水平时未显示出可见条带。

图3 氯霉素改变SH-SY5Yρ+细胞AD相关生物学

      为了验证氯霉素对SH-SY5Y ρ+细胞的影响是否由mtDNA转录本翻译的抑制所介导，作者团队使用相同的时间和浓度处理了SH-SY5Y ρ0细胞。由于ρ0细胞缺乏mtDNA，无法表达mtDNA衍生的转录本，也无法形成线粒体核糖体。实验结果显示，与亲本SH-SY5Y细胞中发生的变化不同，在ρ0细胞中，包括NDUFB8 mRNA、APOE mRNA、APP总蛋白和GSK-3β ser9-磷酸化水平等参数均未出现显著变化（图4A-D）。同时，COX4亚基蛋白水平在ρ0细胞中增加，这与ρ+细胞中观察到的COX4降低趋势相反（图4E，与图2A对比）。此外，ρ0细胞的线粒体在有或没有氯霉素的条件下几乎不消耗氧气，且细胞外酸化率（ECAR）未见显著差异（图4F，G）。这些结果表明，氯霉素对mtDNA转录本的特异性抑制在ρ+细胞中产生的效应在ρ0细胞中无法实现。

图4 在氯霉素处理的SH-SY5Yρ0细胞中没有观察到氯霉素诱导的SH-SI5Yρ+细胞变化

     作者团队将实验扩展至人类iPSC衍生的前脑神经元，所使用的氯霉素剂量和处理时间参数未降低细胞活力（图5A）。与SH-SY5Y ρ+细胞的情况类似，氯霉素处理降低了iPSC神经元中MT-CO2和MT-ND3蛋白水平，并伴随着mtDNA拷贝数的增加和MTCO2、MTND3 mRNA水平的上升（图5B-E）。此外，研究还显示在iPSC衍生的神经元中，MTCO1和MTND1 mRNA的水平也显著增加（图5F、G）。然而，与SH-SY5Y ρ+细胞的表现不同，氯霉素处理后基础耗氧率（OCR）反而有所增加，并且在寡霉素和FCCP的处理下也表现出反应（图5H）。基础细胞外酸化率（ECAR）并未显著增加，但在添加寡霉素后，处理的神经元ECAR上升幅度大于未处理的神经元（图5I）。氯霉素处理使神经元的COX Vmax活性显著降低（图5J），但相比SH-SY5Y ρ+细胞中观察到的85%下降，这种下降比例相对较小（约40%）（与图1H对比）。与SH-SY5Y ρ+细胞不同，氯霉素处理还引起了神经元中柠檬酸合酶（CS）Vmax活性的增加（图5K）。这些数据揭示了氯霉素在不同细胞类型中的作用具有细胞特异性差异。

图5 在氯霉素抑制iPSC衍生的神经元mtDNA转录翻译，诱导线粒体DNA拷贝数和转录的代偿性变化，并改变生物能量通量和酶功能

     在反映SH-SY5Y ρ+细胞的基础上，作者团队发现氯霉素处理的人类iPSC衍生神经元也表现出COX4蛋白的减少，但与SH-SY5Y ρ+细胞不同，神经元中的COX4 mRNA水平有所增加（图6A、B）。与SH-SY5Y ρ+细胞一致，NDUFB8蛋白水平在氯霉素处理后下降，但与此相反的是，神经元中NDUFB8 mRNA水平增加（图6C、D）。此外，虽然氯霉素对SH-SY5Y ρ+细胞的VDAC1蛋白水平没有显著影响，但在神经元中氯霉素处理却显著增加了VDAC1蛋白的水平（图6E）。进一步地，氯霉素处理的神经元显示出PPARGC1A mRNA水平的升高（图6F），并且COX10基因编码的mRNA量也有所增加（图6G）。这些结果表明氯霉素在神经元和SH-SY5Y ρ+细胞中引发了不同的基因表达和蛋白质调控反应，展示出细胞类型特异性。

图6 氯霉素对iPSC衍生的神经元核编码、线粒体相关基因和蛋白质的影响

与SH-SY5Y ρ+细胞相似，氯霉素处理对神经元的apoE/APOE、APP和tau的生物学表现产生了显著影响。具体来说，APOE mRNA水平显著上升（图7A）。通常情况下，apoE蛋白会分泌到培养基中，氯霉素处理的神经元中培养基内apoE蛋白的量增加了160%（图7B）。神经元内全长apoE的数量也增加了一倍，并且可能伴随着C端衍生物的小片段（约12 kD）水平的显著上升，这使得小片段与全长apoE蛋白的比例增加（图7C）。氯霉素处理后，APP mRNA和总APP蛋白水平均升高。尽管在神经元中观察到APP的两个条带，但其分离并不像在SH-SY5Y细胞中那么明显，条带的比例也没有显著变化（图7D、E）。此外，BACE1蛋白水平增加了80%（图7F）。培养基中Aβ42的量超过了ELISA试剂盒的检测阈值，氯霉素处理的神经元中Aβ42的含量增加了85%（图7G）。MAPT mRNA、总tau蛋白、丝氨酸404磷酸化tau蛋白和丝氨酸9磷酸化的GSK-3β蛋白水平均显著增加（图7H-J）。SNCA mRNA水平几乎增加了一倍，α-突触核蛋白的量增加了14.5倍（图7K、L）。这些结果显示氯霉素对神经元的AD相关生物学特征有广泛而深远的影响。

图7 氯霉素改变iPSC衍生的神经元AD相关生物学

作者团队将对照组和氯霉素处理的神经元放置在盖玻片上，使用针对TOMM20和apoE N末端区域的抗体进行染色，并分析单个神经元内TOMM20和apoE的免疫荧光水平（图8A）。实验结果表明，神经元中apoE与TOMM20蛋白的数量存在显著的负相关关系，这种趋势在对照组和氯霉素处理组中均有所体现。通常情况下，表现出强烈apoE染色的神经元，其TOMM20染色强度往往较低（图8B、C）。这一发现表明氯霉素处理可能影响神经元中apoE与线粒体功能相关蛋白之间的调控关系。

图8 iPSC衍生神经元中apoE和TOMM20蛋白水平的负相关

      作者团队通过抑制线粒体DNA编码转录本的翻译，在人类神经元细胞和iPSC衍生的神经元中诱导持续的原发性线粒体功能障碍状态。为此，使用了氯霉素，这是一种抑制线粒体核糖体功能的抗生素。实验结果表明，降低线粒体DNA编码蛋白水平证实了靶标的参与，而SH-SY5Y ρ0细胞并未表现出在SH-SY5Y ρ+细胞中观察到的变化，证明了这种抑制的靶标特异性。在实验中，神经元细胞在氯霉素处理后至少存活1周，这段时间足以启动分子适应。此期间，ρ+模型表现出线粒体内外的适应性变化，并且未观察到过量或过度的细胞死亡，表明这些反应主要是促生存的，而非濒死的事件。评估结果还显示，氯霉素处理的神经元和细胞经历了线粒体质量的提升，例如mtDNA拷贝数增加、mtDNA转录和PPARGC1A表达的增加。此外，神经元中还观察到VDAC1蛋白、耗氧率（OCR）、核编码呼吸链mRNA表达及柠檬酸合酶（CS）Vmax活性的增加。然而，这些细胞在氯霉素处理下核编码呼吸链蛋白含量减少，显示出核编码呼吸链基因mRNA水平的增加并未充分转化为蛋白质水平，可能是由于翻译效率低下或蛋白质无法稳定。OCR反应的差异可能受多种因素影响，包括肿瘤衍生和非肿瘤衍生细胞的不同需求及策略。SH-SY5Y和iPSC衍生细胞在毒素敏感性和弹性上的差异也可能是一个原因。研究发现氯霉素处理的神经元持续增加核编码呼吸链mRNA水平，而在SH-SY5Y ρ+细胞中则未观察到类似现象，这可能是由于对神经元mtDNA转录翻译的抑制较少，仍能维持残留的COX活性，满足生物能量需求。核基因mRNA的变化强调了线粒体-核串扰的重要性。不同系统中可能使用多种机制来进行这种通讯，如氧化应激、乙酰辅酶A运输、线粒体未折叠蛋白反应（mtUPR）和综合应激反应（ISR）等。阐明这种串扰的机制有助于理解与年龄相关疾病（如阿尔茨海默病）中的大脑健康变化。氯霉素处理的实验数据表明，抑制线粒体翻译会影响apoE/APOE、APP、tau和α-突触核蛋白的表达和处理，与阿尔茨海默病的病理特征相关。尽管一些结果提供了线索，但也存在不一致和复杂性，表明需要进一步研究来探究线粒体功能障碍在阿尔茨海默病中的具体作用机制。研究模型展示了线粒体翻译抑制对细胞生物学和阿尔茨海默病特征的深远影响，为未来探索相关假说提供了依据和工具。

精读文献请下载原文：

Alexander P Gabrielli, Lesya Novikova, Amol Ranjan, et al. Inhibiting mtDNA transcript translation alters Alzheimer's disease-associated biology. Alzheimers Dement. 2024 Oct 23. doi: 10.1002/alz.14275.