Nat Commun：成年小胶质细胞TGFβ1维持小胶稳态以保持小鼠的认知功能

导读：

      虽然TGF-β信号传导对小胶质细胞的功能至关重要，但成年CNS中TGF-β1配体的细胞来源及其空间调控仍不清楚。近期，《Nature Communications》期刊上发表了题为“Adult microglial TGFβ1 is required for microglia homeostasis via an autocrine mechanism to maintain cognitive function in mice”的论文，作者团队的数据支持小胶质细胞而不是星形胶质细胞或神经元是小胶质细胞稳态所需的TGF-β1配体的主要生产者。小胶质细胞Tgfb1 KO导致小胶质细胞活化，其特征是具有类似于疾病相关、损伤相关和衰老的小胶质细胞，表明小胶质细胞自发产生的TGF-β1配体在成人中枢神经系统中很重要。MG-Tgfb1诱导型（i）KO小鼠中的星形胶质细胞显示出与LPS相关的星形胶质细胞谱密切相关的转录组谱。此外，利用TGF-β1配体的稀疏嵌合单细胞小胶质细胞KO建立了信号传导的自分泌机制。本研究表明MG-Tgfb1 iKO小鼠表现出认知缺陷，这支持了对源自小胶质细胞的TGF-β1配体的精确空间调节是维持成人脑内稳态和正常认知功能所必需的。

     为了确定中枢神经系统中为小胶质细胞和其他TGF-β1应答细胞提供TGF-β1配体的细胞类型，作者团队首先检查了先前研究中发表的scRNAseq数据集。在多个scRNAseq数据集中观察到成年小鼠小胶质细胞中高度富集的Tgfb1 mRNA水平。对这些数据的进一步分析表明，星形胶质细胞、神经元和少突胶质细胞的Tgfb1表达极少。尽管少突胶质前体细胞(OPCs)和内皮细胞具有可检测到的Tgfb1表达水平，但与小胶质细胞Tgfb1 mRNA水平相比，这些表达水平要低得多(补充图1A, B)。通过搜索已发表的人类scRNAseq数据集，作者团队发现几项独立的人类研究显示Tgfb1基因在小胶质细胞中表达类似富集(补充图1C, D)，而另一项独立研究显示Tgfb1仅在AD患者的小胶质细胞中表达富集，而在对照小胶质细胞中没有表达。为了验证Tgfb1在小鼠脑中的表达，他们进行了RNAscope/IHC联合分析，以检测Tgfb1在成年小鼠脑中的细胞表达模式。他们的数据显示，Tgfb1 mRNA确实在Iba1阳性的小胶质细胞中富集，但在神经元中未检测到(补充图1E)。Tgfb1 mRNA也在一小部分非Iba1+细胞中检测到，这些细胞可能是内皮细胞或其他胶质细胞。在小胶质细胞中也检测到1型TGF-β1受体(TGF-βR1或ALK5)的mRNA，支持小胶质细胞既是TGF-β1信号的配体产生细胞，也是响应细胞。为了检验小胶质细胞是否是大脑中TGF-β1产生的主要贡献者，他们使用成熟的集落刺激因子1 (CSFR1)拮抗剂PLX5622受体(饮食中1200ppm)，按照之前发表的方案，从成年小鼠大脑中去除小胶质细胞(补充图1F)，这导致作者团队和其他研究报道的90%以上的小胶质细胞消融。在小胶质细胞消融成功后，作者团队检测了对照或小胶质细胞消融小鼠大脑皮质组织中Tgfb1 mRNA的总量。qRT-PCR分析显示，PLX5622处理导致成人大脑中小胶质细胞的大量消耗，表现为脑组织中Iba1 mRNA水平显著下降(< WT水平的5%)，同时Tgfb1 mRNA总水平下降70%(补充图1G)。由于小胶质细胞仅占总脑细胞的5-10%，因此小胶质细胞消融导致脑中Tgfb1 mRNA总水平下降70%，这支持了小胶质细胞是TGF-β1配体产生的主要成分。

补充图1.Tgfb1基因表达在成年小鼠和人大脑的小胶质细胞中富集

      接下来，为了确定小胶质细胞产生的TGF-β1配体与小胶质细胞稳态的直接功能相关性，作者团队将Cx3cr1^CreER系与Tgfb1^fl/fl系杂交，使TAM诱导的TGF-β1配体在成年期小胶质细胞中丢失。为了确认诱导型MG-Tgfb1 KO小鼠小胶质细胞中Tgfb1基因缺失的效率，在作者团队最近的研究中，在Cx3cr1^CreERTgfb1^wt/wtR26-YFP和Cx3cr1^CreERTgfb1^fl/flR26-YFP小鼠中用TAM处理3周后，使用R26-YFP（黄色荧光蛋白）报告等位基因（标记成年小鼠脑中约90%的总小胶质细胞）对小胶质细胞进行分类。作者团队证明，与对照小胶质细胞（Cx3cr1^CreERTgfb1^wt/wt）相比，Cx3cr1^CreERTgfb1^fl/fl小鼠中分选的YFP+小胶质细胞的Tgfb1 mRNA水平显著降低（99.8%）（图1A，右）。为了检查作者团队的MG-Tgfb1 iKO小鼠的外周血清或组织TGF-β1水平是否也受到影响，作者使用酶联免疫吸附试验（ELISA）分析测量了血清和脾脏中的TGF-β1蛋白水平。与之前的“CNS-Tgfb1”组成型KO小鼠模型相比，在TAM治疗后3周，Cx3cr1^CreERTgfb1 iKO小鼠的血清或脾脏TGF-β1蛋白水平在Cx3cr1^CreER WT和Cx3cr1^CreERTgfb1^fl/fl小鼠之间没有差异（补充图2），证实了对外周TGF-β1配体水平的干扰很小。作者团队的ELISA结果还表明，与脾脏和血清中高水平的TGF-β1配体相比（对照组和iKO脾脏=5.7 pg/ug或5.9 pg/ug蛋白：对照组和iKO血清=1.9 pg/ug或者1.8 pg/ug蛋白质），大脑总TGF-β1水平显著降低（低于ELISA检测的检测限），这一结果与最近的一项独立研究一致。这表明，鉴于TGF-β配体丰度的显著差异，血液/外周器官中TGF-β配体的产生和释放可能与中枢神经系统明显不同。由于这种分析方法的局限性，鉴于总脑TGF-β蛋白水平较低，作者团队无法直接使用ELISA测定法确认Cx3cr1^CreER-Tgfb1 iKO小鼠中TGF-β1配体在蛋白质水平上的损失。接下来，作者团队尝试使用荧光活化细胞分选(FACS)分析表面TGF-β1水平，结果类似。FACS分析还显示，与脑髓细胞相比，脾髓细胞中细胞表面TGF-β1的表达明显更高(补充图2)。这一发现进一步支持了中枢神经系统TGF-β1水平远低于外周组织。作者团队的FACS分析显示，在CD11b+/CD45+脾细胞表面检测到TGF-β1蛋白，但在该群体中，对照组和Cx3cr1^CreERTgfb1 iKO小鼠之间没有差异。这证实了iKO小鼠模型不会影响外周髓系细胞中TGF-β1的表达。然而，由于来自大脑的CD11b+/CD45+细胞显示出非常低的TGF-β1抗体结合水平，作者团队无法自信地比较对照组和Cx3cr1^CreER-Tgfb1^fl/fliKO小鼠脑髓系细胞表面TGF-β1的表达水平。然而，对分选的脑髓系细胞进行qRT-PCR分析表明，Cx3cr1^CreERTgfb1^fl/fl转基因系可以有效地删除这些细胞中的Tgfb1基因，对全身血清或脾脏TGF-β1水平的干扰最小。此外，分选的WT和Tgfb1 iKO CNS髓系细胞的RNAseq证实，iKO小鼠中Tgfb1 mRNA的固定外显子3缺失，但不影响3'loxP位点下游的外显子4的mRNA计数（补充图2）。使用外显子3特异性引物/探针组的qRT-PCR分析也验证了iKO小鼠分选的小胶质细胞中Tgfb1基因的有效重组（图1A，右）。

     为了进一步规避直接检测低水平TGF-β1蛋白在中枢神经系统中的挑战，作者团队分析了TGF-β1信号的下游效应，即核定位磷酸化SMAD3 (pSMAD3)蛋白水平。联合免疫组织化学分析显示，在对照小鼠(Cx3cr1^CreER+/-Tgfb1^wt/wt+TAM)中，pSMAD3在大脑中的IBA1+小胶质细胞和IBA1-细胞中都检测到(图1A，右侧和B, E，下行)。MG特异性缺失Tgfb1基因导致pSMAD3免疫反应性明显且显著降低，仅在IBA1+小胶质细胞中，而不影响IBA1-细胞中的pSMAD3免疫染色(图1B-E底行和F、G中的定量)。 MG-Tgfb1 iKO小鼠小胶质细胞中TGF-β1信号通路(pSMAD3)的特异性缺失证实了小胶质细胞TGF-β1信号通路依赖于小胶质细胞产生的TGF-β1配体，而这种配体不能被其他细胞补偿。

图1 Cx3cr1^CreER(Jung)驱动系中小胶质细胞特异性Tgfb1基因缺失导致成年小鼠大脑皮层小胶质细胞稳态丧失和反应性星形胶质细胞增加

     接下来，作者团队评估了小胶质细胞来源的TGF-β1配体的缺失是否会影响成年小鼠(6-10周龄雌性和雄性)的小胶质细胞形态和稳态状态。在TAM给药后3周和12周，与对照小鼠相比，MG-Tgfb1 iKO小鼠的小胶质细胞发生了实质性形态学变化(图1B-E，IBA1染色)。IBA1+细胞形态在iKO小鼠中的这种变化表明小胶质细胞分支的丧失和潜在的激活，这促使作者团队进行额外的详细形态学分析和对稳态小胶质细胞特征基因的检查。小胶质Tgfb1 KO后，Cx3cr1^CreER(Jung) Tgfb1 iKO小鼠的小胶质细胞分支减少，与对照小胶质细胞相比，过程末端数量减少(图1H，对照组=33,3周iKO=15, 12周iKO=13)和总分支长度减少(图1I，对照组=330µm, 3周iKO=149µm, 12周iKO=140µm)。此外，Tgfb1 iKO小胶质细胞显示稳态小胶质细胞特征基因如P2ry12和Tmem119的表达减少(图1B-E, P2ry12和Tmem119染色)。这些结果与受损的小胶质稳态状态一致，并且与另一项使用Sall1^CreERTgfbr2^fl/fl小鼠的独立研究一致，该研究显示出类似的形态学变化，但没有检测P2ry12和Tmem119的表达。值得注意的是，他们观察到的表型比之前的两项研究更为严重，在这两项研究中，成人小胶质TGF-β信号通过TGF-βR2的KO而被消除。这可能是由于在这种Tgfb1连接的小鼠中，两个loxP位点之间的距离很短，使得Tgfb1基因的重组效率很高。这些结果支持了小胶质细胞TGF-β1信号通路依赖于小胶质细胞产生的TGF-β1配体的观点，成人中枢神经系统中其他细胞类型产生的TGF-β1配体不能弥补小胶质源性TGF-β1配体的缺失。此外，对Cx3cr1^CreER(Jung)Tgfb1^fl/fl-R26YFP和Cx3cr1^CreER(Jung)Tgfb1^wt/wt-R26YFP小鼠的YFP报告器跟踪显示，IBA1+或YFP+细胞的总数在iKO小鼠中均有所增加(图1K)，而在TAM后3周或12周，对照组与iKO小鼠的IBA1+细胞中YFP+的百分比保持不变(图1L)。这表明，在TAM治疗后的几周内，大多数重组的小胶质细胞仍留在中枢神经系统中，可能不会被YFP浸润的单核细胞所取代。与对照组Cx3cr1^CreER(Jung)Tgfb1^wt/wt小鼠相比，在TAM治疗后3周和12周，Cx3cr1^CreER(Jung)Tgfb1^fl/fl小鼠中也观察到反应性星形胶质细胞的增加(由胶质纤维酸性蛋白(GFAP)表达上调表示，图1B-E，图1J定量)。本研究使用两个独立的Cx3cr1^CreER小鼠驱动因子来确认表型。在TAM治疗后5周和8周，他们在Cx3cr1^CreER(Litt)Tgfb1^fl/fl小鼠中观察到类似的表型，但在Cx3cr1^CreER(Litt) Tgfb1^wt/wt对照小鼠中却没有（补充图3）。在其他脑区域也观察到小胶质细胞和星形胶质细胞的类似表型（补充图4显示海马为另一个例子，注意与皮层星形胶质细胞大多是GFAP-不同，许多海马星形胶质细胞在WT小鼠中已经是GFAP+稳态）。在新生小鼠中消除TGF-β1配体表达(TAM在Cx3cr1^CreER(Jung)Tgfb1^fl/fl iKO中以P3-P5处理)会产生类似激活的小胶质细胞表型，其分支形态减少，并且整个大脑中稳态小胶质细胞标记物显著丢失(补充图5，显示了体感觉皮质区域的代表性图像)。这表明小胶质细胞衍生的TGF-β1配体也需要维持出生后早期小鼠大脑的内稳态。作者团队观察到雄性和雌性iKO小鼠在新生期和成年期的表型相似(图1和补充图5)。其结果与最近一项独立研究一致，该研究调查了胚胎发育过程中TGF -β1配体的起源。

     成年MG-Tgfb1 iKO小鼠的小胶质细胞和星形胶质细胞均被激活。因此，尚不清楚小胶质细胞衍生的TGF-β1配体的丢失是由于每种细胞类型的信号减少而直接导致两种细胞类型的激活，还是这种丢失影响了一种细胞类型并间接激活了另一种细胞类型。为了回答这个问题， 作者团队制造了小胶质细胞特异性或星形胶质细胞特异性TGF-β1型受体（Alk5）的iKO小鼠。他们的数据显示，小胶质细胞中TGF-β信号的缺失(通过Alk5基因的缺失)导致小胶质细胞的激活，其表现为分支形态的缺失，以及稳态特征基因(P2ry12和Tmem119)的表达减少和活化的小胶质细胞标志物(CD68)的表达增加(图2A-G)。当他们删除小胶质细胞中的TGF-β受体时，MG-Alk5 iKO小鼠的星形胶质细胞也被激活(图2C, G)，这表明Tgfb ko MG中小胶质细胞和星形胶质细胞之间的串扰是星形胶质细胞激活的原因。事实上，在星形细胞-Alk5 cKO小鼠系中，当通过mGfapCre驱动程序在星形细胞中删除Alk5时（图2H，右），星形细胞既没有显示GFAP表达表型的增加，小胶质细胞也没有显示分支形态的丧失或稳态标记表达的减少（图2H-M）。

图2 ALK5依赖性TGF-β信号传导是维持小胶质细胞稳态所必需的，但不是星形胶质细胞稳态的必要条件

      先前的研究表明，星形胶质细胞产生的TGF-β配体可能在血脑屏障形成、稳定和成熟以及损伤或疾病后的神经保护中发挥重要作用。因此，作者团队下一步研究了星形胶质细胞特异性Tgfb1基因的缺失是否同样会导致小胶质细胞形态的改变和基因表达的变化，如P2ry12、Tmem119和Cd68。此外，他们在Cx3cr1^CreERTgfb1或Cx3cr1^CreERAlk5 iKO小鼠中观察到星形细胞Tgfb1基因的缺失是否也会引起星形细胞反应性的变化。为了靶向成年星形胶质细胞，将具有良好特征的Aldh1l1^CreER小鼠与Tgfb1^fl/fl小鼠杂交，生成星形胶质细胞Tgfb1 iKO小鼠(Aldh1l1^CreERTgfb1^fl/fl)。给药后8周，观察小胶质细胞形态和星形胶质细胞状态。与对照小鼠（Aldh1l1^CreERTgfb1^wt/wt小鼠或Tgfb1^fl/fl小鼠）相比，Aldh1l1^CreERTgfb^1fl/fl动物的小胶质细胞形态保持不变（图3A-I为皮质，补充图6为海马）。

     此外，在稳态小胶质细胞特征基因(P2ry12或Tmem119，图3H,I)中未观察到变化。在TAM治疗后8周，将Aldh1l1^CreERTgfb1^fl/fl动物与WT对照组进行比较时，作者团队也未观察到小胶质细胞中CD68的上调或星形胶质细胞中GFAP表达的增加(图3F, G和补充图6)。这一结果进一步证实星形胶质细胞中TGFβ1的产生并不需要维持小胶质细胞的稳态形态。

图3 Aldh1l1^CreER或Camk2^CreER驱动基因中星形胶质细胞特异性或前脑神经元特异性Tgfb1基因缺失不影响成年小鼠大脑（皮质）中小胶质细胞的稳态或星形胶质细胞中GFAP的表达

      接下来，作者团队研究了神经元是否是成人小胶质细胞生成TGF-β1配体的另一个来源。为此，作者团队建立了一个前脑兴奋性神经元特异性Tgfb1 iKO小鼠模型。为了靶向前脑神经元，他们将Camk2^CreER系与Tgfb1^fl/fl系杂交，在兴奋性神经元中诱导TGF-β1配体KO。据报道，Camk2a^CreER在皮质、海马体和纹状体中广泛重组。TAM给药8周后，与WT对照组相比，Camk2a^CreERTgfb1^fl/fl小鼠的小胶质细胞形态保持不变（图3J-R为皮质，补充图9为海马）。此外，未观察到小胶质细胞中TMEM119或P2RY12表达的改变，也未观察到GFAP表达的增加。这支持了小胶质细胞不依赖于神经元TGF-β1配体来维持成人大脑内稳态的观点。

      Cx3cr1^CreER系以前曾被报道也靶向存在于软脑膜和血管中的边界相关巨噬细胞(BAMs)中。此外，两个Cx3cr1^CreER小鼠品系用cre表达盒替换了内源性Cx3cr1基因，导致两个对照组(Cx3cr1^CreERTgfb1^wt/wt)和iKO (Cx3cr1^CreERTgfb1^fl/fl)小鼠中Cx3cr1基因的杂合性。为了进一步提高对实质小胶质细胞的靶向特异性，最近产生了Tmem119^CreER和P2ry12^CreER小鼠品系，利用稳态小胶质细胞特征基因启动子驱动CreER盒表达，而不影响Tmem119或P2ry12的内源基因表达。作者团队和其他最近的研究报道，Tmem119^CreER和P2ry12^CreER小鼠品系显示出较少的TAM-非依赖性“泄漏”重组事件，但是具有较低重组效率的缺点，这导致在这两个小鼠品系中只有小胶质细胞的子集被重组(基于R26-YFP报道基因表达和分选的小胶质细胞的qRT-PCR结果，图4A，右)。P2ry12^{CreER(mut/mut)}小鼠品系中纯合的CreER等位基因的两个拷贝增加了总重组效率，但没有达到Cx3cr1^CreER品系的程度(图4A，右)。为了检测实质小胶质细胞亚群中TGF-β1配体的嵌合基因缺失是否会在小胶质细胞中产生任何表型，他们将Tmem119^CreER和P2ry12^CreER(杂合cre或纯合cre)与Tgfb1^fl/fl系杂交，产生不同的实质-小胶质细胞特异性Tgfb1 iKO系，其具有不同程度的嵌合MG-Tgfb1缺失。

    为了研究小胶质细胞Tgfb1的部分缺失是否仍能破坏在Cx3Cr1^CreERTgfb1 iKO细胞系中观察到的小胶质细胞稳态，作者团队接下来评估了Tmem119^CreER(杂合cre)和P2ry12^CreER(杂合和纯合cre) Tgfb1 iKO小鼠。与R26-YFP报道基因的镶嵌重组和Tmem119^CreER和P2ry12^CreER小鼠品系中成年小胶质细胞中Tgfb1 mRNA水平的部分降低相一致(图4A，右)，在TAM给药后5周，作者团队在Tmem119^CreERTgfb1和P2ry12^CreERTgfb1 iKO小鼠中观察到具有活化形态的小胶质细胞斑块的不同(图4B–D),小胶质细胞中不同程度的活化与Tgfb1基因缺失效率的程度相一致(图4A-C，定量图4F–H)。在P2ry12 ^{CreER(mut/mut)}Tgbfb1^fl/fl iKO小鼠中有两个CreER等位基因拷贝,该表型更严重，超过50%的小胶质细胞失去TMEM119表达(图4E ),并且TMEM119蛋白下调程度中等但显著(图4F)和部分分支损失(图4G，H),甚至在相邻的TMEM119+斑块中也是如此。在对照Tmem119^CreERTgfb1^wt/wt或P2ry12^CreERTgfb1^wt/wt TAM小鼠中未观察到P2ry12和Tmem119表达的形态学变化和损失(补充图10)。为了研究Tgfb1 KO小胶质细胞是否随时间推移而死亡，以及活化的IBA1+细胞是否为浸润的单核细胞，作者团队在这些小鼠品系中杂交了R26YFP报道等位基因。作者的数据显示，总IBA1+细胞在P2ry12^{CreER(mut/mut)}TGFB1^fl/fl iKO小鼠中增加，这与该细胞系中影响更高小胶质细胞群体的更严重的表型一致(补充图10B和10D)。然而，在所有上述三种小鼠品系中，WT和iKO小鼠中YFP+细胞占总IBA1+细胞的百分比保持相同(补充图10A-C，定量图E和G)。值得注意的是，并不是所有的iKO小胶质细胞都会被YFP报道基因标记，因为不同的固定等位基因的重组是独立的，尤其是固定的Tgfb1等位基因比R26-YFP盒短得多。然而，在这些小胶质细胞特异性CreER系中，活化的YFP+小胶质细胞斑块和相似的YFP+小胶质细胞百分比支持了这样的观点，即确实是实质小胶质细胞被活化，而不是被浸润的YFP阴性外周单核细胞所取代。

     作者团队还观察到在这些嵌合小胶质细胞-Tgfb1配体iKO小鼠大脑的皮质中星形胶质细胞斑块的激活增加(通过GFAP免疫反应性可见)(图4B–D)。在群体水平上(使用整个成像视野分析)，作者观察到小胶质细胞活化程度和星形胶质细胞GFAP免疫反应性之间存在中度相关性(图4I)，这与他们的假设一致，即小胶质细胞中TGF-β1配体的缺失导致小胶质细胞内稳态的丧失，进而激活星形胶质细胞。为了进一步研究局部稳态失调的小胶质细胞和活化的星形胶质细胞之间是否存在密切的空间相关性，作者分析了稳态失调的TMEM119-小胶质细胞的每个个体斑块和局部星形胶质细胞活化或与稳态失调的小胶质细胞区域物理接触的GFAP+星形胶质细胞。数据显示，与局部星形胶质细胞活化相关的所有分析参数与局部镶嵌小胶质细胞活化呈正相关(图4K-4M)，支持小胶质细胞和星形胶质细胞之间精确的局部串扰。

图4 P2ry12^CreERTgbfb1^fl/fl或Tmem119^CreERTgfb1^fl/fl iKO小鼠脑实质小胶质细胞亚群中Tgfb1基因的嵌合缺失导致成年小鼠脑中不同的稳态失调小胶质细胞斑块

  值得注意的是，在Tmem119^CreERTgfb1^fl/fl和P2ry12^CreERTgfb1^fl/fl杂合CreER小鼠(其具有镶嵌型Tgfb1基因缺失)中，少数Tgfb1 KO小胶质细胞的独特镶嵌斑块显示出改变的形态和稳态小胶质细胞标志基因表达的丧失，这些斑块被能够产生TGF-β1配体的野生型小胶质细胞所包围(图4)。这提出了一个有趣的问题，即个体小胶质细胞是否依赖于以自分泌方式分泌的自身产生的TGF-β1配体，或者个体小胶质细胞是否可以通过旁分泌机制利用来自邻近小胶质细胞的TGF-β1配体。

     为了进一步研究单个小胶质细胞产生TGF-β1配体的空间分辨率，并研究单个小胶质细胞是否依赖于自分泌机制产生的TGF-β1配体，作者团队使用带有滴定TAM稀释的Cx3cr1^CreER(Jung)Tgfb1^fl/fl系设计了一种镶嵌稀疏重组策略。为了实现稀疏重组，他们首先在Cx3cr1^CreERR26-YFP报告基因系中对其进行了测试。利用这种报道小鼠品系，作者测试了在全剂量重组中使用的浓度(180 mg/kg)的1:50和1:7-1:10的TAM剂量。结果显示，对于1:50和1:7–1:10的TAM剂量，他们在实质中观察到非常少量的YFP+细胞，也是P2RY12+(表明稀疏重组可以发生在实质小胶质细胞而不是BAMs中)(补充图11)。该结果支持了使用TAM剂量滴定在被WT小胶质细胞包围的个体小胶质细胞中诱导稀疏基因缺失的可行性。由于1:7–1:10的剂量范围提供了足够稀疏的重组事件，作者用该剂量范围进行了后续实验，给Cx3cr1^CreER(Jung)TGFB1^fl/fl R26-YFP或对照小鼠服用稀释剂量为1:7 (25mg/kg)的TAM。这导致Cx3cr1^CreER(Jung)系小胶质细胞的稀疏标记，允许单细胞分析小胶质细胞是否依赖自我分泌的TGF-β1配体来维持其体内平衡。值得注意的是，在TAM给药后2-3周，作者在Cx3cr1^CreER(Jung)TGFB1^fl/flR26-YFP TAM处理的小鼠(图5C，总IBA1+细胞的G <10%)的实质中观察到分离的少数的单个IBA1+细胞，其呈现改变的形态(较少分枝，图5C，J和K)，伴随着TMEM119表达的减少(图5C，H蓝色柱和补充视频1)。这些少数突变的单个IBA1+细胞位于脑实质中，并且不显示典型的血管相关巨噬细胞形态(图5C)。然而，YFP+/TMEM119/IBA 1+细胞的百分比非常低(图5F),表明在这种低水平的TAM剂量下，在单细胞水平上，R26-YFP报道等位基因的重组可以独立于靶向固定基因的缺失而发生，这一结果也得到他们最近在小胶质细胞中使用双报道等位基因的研究的支持。在Cx3cr1^CreERTgfb1^wt/wtR26-YFP TAM处理的小鼠中，作者观察到类似频率的稀疏YFP+小胶质细胞(图5E ),但没有发现任何个体非BAM小胶质细胞表现出活化小胶质细胞的这种表型(图5B，G),这表明Cx3cr1^CreERTgfb1^fl/fl小鼠中稀疏的个体“活化”小胶质细胞是由于单一稀疏小胶质细胞中TGF-β1配体的缺失。

图5 在个体成年小胶质细胞中稀疏诱导的Tgfb1基因敲除支持小胶质细胞TGF-β配体产生和信号调节的自分泌机制

     为了进一步证实这一假设，作者团队使用与他们用于证实小胶质细胞TGF-β1表达的相同的Tgfb1 RNAscope探针进行了联合免疫组织化学(IHC)/RNAscope(图6A，B)。事实上，作者团队在个体小胶质细胞中观察到显著降低的Tgfb1 RNAscope探针杂交，其具体表现为伴随TMEM119表达缺失的形态学改变，而周围的IBA1+/TMEM119+小胶质细胞表现出正常的TGF-β1 RNAscope信号(图6B，C)。作者进一步进行了免疫染色，以检测镶嵌稀疏MG-Tgfb1 iKO脑中TGF-β1信号传导的下游信号效应子(pSMAD3),并证实在TMEM119-和形态学改变的稀疏个体小胶质细胞中特异性检测到pSMAD3的缺失(图6D，E和补充的图12用于额外的图像实例)。因此，作者的结果表明，在稳态生理条件下，小胶质细胞对自分泌TGF-β1信号的精确空间调节依赖于自身产生的TGF-β1配体。接下来，作者探寻在TAM术后2-3周，个体Tgfb1 KO小胶质细胞内稳态的丧失是否会随着时间的推移而持续，或者对于周围的野生型小胶质细胞，个体Tgfb1 KO小胶质细胞是否可以恢复稳态。在稀疏MG-Tgfb1 iKO小鼠中TAM治疗后8周，不再观察到稀疏TMEM119阴性和形态学改变的小胶质细胞的表型(图5D，F，I)。这表明，在稀疏镶嵌MG-Tgfb1基因缺失模型中，TAM治疗后8周，这些稀疏的Tgfb1 KO小胶质细胞可能恢复体内平衡(通过正常的分支形态和TMEM119表达的恢复来指示)。由于R26-YFP报道等位基因不能同时标记非常稀疏的Tgfb1 KO小胶质细胞，作者不能使用YFP报道基因纵向追踪单个Tgfb1 KO小胶质细胞。然而，在TAM处理的Cx3cr1^CreER-Tgfb1 iKO小鼠的全剂量中，作者没有看到由于TAM后12周细胞死亡而导致的YFP+细胞减少。此外，作者在大多数小胶质细胞(YFP+)中观察到持续激活的表型，在TAM治疗后长达12周(图1E)，这表明当大多数小胶质细胞失去TGFβ1配体时，与个别稀疏激活的小胶质细胞相比，可能更难恢复。

图6 原位RNA范围和IHC双重标记证实，在稀疏Tgfb1 iKO模型中，稳态失调的个体小胶质细胞中Tgfb1 mRNA的缺失和TGF-β下游信号传导（pSMAD3）的下调

      为了进一步表征小胶质细胞TGF-β1配体缺失后的转录变化，基于YFP表达或ASCA2免疫标记(补充图13和7) ，在TAM施用后3周，从Cx3cr1^CreER(Jung)TGFB1^fl/flR26-YFP和Cx3cr1^CreER(Jung)TGFB1^wt/wtR26-YFP动物中分选小胶质细胞和星形胶质细胞，并进行RNAseq分析。作者团队基于重组YFP报告基因表达(标记全脑约90%的实质小胶质细胞)而不是CD11b+/CD45低来分选脑小胶质细胞，以避免潜在的警告，即小胶质细胞中TGF-β信号传导的缺失可能增加CD45表达，并选择性富集KO脑中小胶质细胞亚群。此外，由于免疫染色数据显示稳态标记如P2RY12或TMEM119在KO小胶质细胞中的下调，不能用这些标记来区分小胶质细胞和BAMs。因此，基于YFP信号门控CNS髓样细胞，它可能包含CNS小胶质细胞和BAMs。主成分分析(PCA)显示野生型小胶质细胞样品和Tgfb1 iKO小胶质细胞明显聚集在一起(补充图14)。热图显示了显著差异表达的基因(补充图14和补充数据1和2)。与最近使用Cx3cr1^CreERTgfbr2^fl/fl受体诱导型KO小鼠的研究相反，其中报道了许多稳态小胶质细胞标记没有变化在KO小鼠中，作者观察到一大组差异表达的基因基因包括许多小胶质细胞稳态信号基因(P2ry12、Tmem119、Sall1等的下调。图7C)和免疫反应调节基因(TNF、Il1b、干扰素反应基因)的上调。使用基因集合富集分析(GSEA)，作者观察到与免疫反应、免疫细胞募集和干扰素反应相关的几种途径的上调(补充图15和补充数据3和4)。作者还观察到血小板聚集途径基因的下调(补充图15)。对于星形胶质细胞，观察到多个LPS相关的星形胶质细胞基因的上调(Serping1，Ifit3，Gbp3，图7D，H)，并且他们还观察到干扰素应答的增加(Irf7，Irf9，图7D)。一致地，GSEA分析也显示了干扰素活性增加和代谢功能降低(NADH、线粒体、乙酰辅酶a，补充图16和补充数据5和6 ),这表明来自MG-Tgfb1 iKO脑的星形胶质细胞中从代谢支持功能到活化的促炎状态的转变。这些数据表明，在小胶质细胞TGF-β1缺失后，小胶质细胞和星形胶质细胞的稳态功能活动被破坏。

     鉴于几个独立的人类scRNAseq数据集表明人类小胶质细胞中TGF-β信号成分的富集相似，作者团队分析了他们的数据集和人类TGF-β缺失的iMGLs数据集，发现在两个数据集中TGF-β信号缺失时重叠基因显著上调或下调。他们在Cx3cr1^CreERTgfbr2^fl/fl小鼠中鉴定了2390个上调和2324个下调基因，在iMGL数据集中报道了1962个上调和1199个下调基因。从这些基因中，作者鉴定了数据集和iMGL数据集共有的237个上调基因和147个下调基因(图7E，F)。对上调和下调的基因列表进行基因本体(GO)分析。上调的基因富含涉及细胞因子信号传导、炎症反应、小GTP酶和NF-κB信号传导途径、对TNF的反应和T细胞调节的基因(图7E和补充数据7)。下调的基因富含涉及树突细胞趋化性和迁移、巨噬细胞迁移、细胞防御反应、II型IFN产生的正向调节和炎症反应的基因(图7F和补充数据7)。许多趋化因子受体在缺乏TGF-β信号传导时下调(Ccr1、Ccr2、Ccr5、Ccr6和Cx3cr1)，而许多趋化因子配体上调(Ccl5、Ccl24、Cxcl1、Cxcl9、Cxcl10和Cxcl16)。趋化因子相关基因在两个列表中的出现解释了为什么上调和下调的基因列表在GO方面有一些重叠。

      作者团队接下来想比较Cx3cr1^CreERTgfb1^fl/fl小胶质细胞和星形胶质细胞与先前以非稳态小胶质细胞状态为特征。对于小胶质细胞，作者审查了以前的多项研究，以生成一个与衰老、中枢神经系统损伤(创伤性脑损伤-TBI)和淀粉样β蛋白病理状况相关的特征基因列表。他们观察到，在小胶质细胞TGF-β1配体缺失三周后，小胶质细胞显示出小胶质细胞稳态基因(Hexb、P2ry12、Tmem119、Cst3、Cd33、Cx3cr1，图7G)的下调，表明稳态异常。他们还观察到衰老小胶质细胞标记基因的表达增加(例如Ifitm3，Ccl12，Il1b Ccl2，Lgals3)，以及损伤相关的TBI信号基因，例如Irf7，Igf1，Cxcl10，Ccl12，Axl，Cd63和Cybb(图7G)。最近，淀粉样β蛋白诱导的小胶质细胞转录组的变化被描述为DAM 1和DAM 2阶段，其转变依赖于TREM2信号传导。在进一步的检查中，作者注意到iKO小胶质细胞中的未成熟基因代表DAM 1标记基因(B2m，Apoe，Tyrobp，但Trem2水平下降)，而iKO小胶质细胞中的下调基因代表DAM 2标记基因(Ccl6，Cst7，Cd9，Csf1，Itgax)，其与iKO小胶质细胞中TREM2的下调密切相关(图7G)。此外，在小胶质细胞TGF-β1缺失后，与通过上调GFAP蛋白观察到的星形胶质细胞的反应性一致，他们观察到一些星形胶质细胞稳态基因(Aldh1l1，Acsl6，Aldoc)的下调，体内LPS相关基因(Gbp3，Gbp2，Gbp6，Psmb8，图7H)的上调，并且在MG-Tgfb1 iKO脑的星形胶质细胞中缺血相关基因没有可辨别的变化(图7H)。

图7 Cx3cr1^{CreER（Jung）}Tgfb1 iKO小鼠小胶质细胞和星形胶质细胞的转录组学分析

     来自小胶质细胞和星形胶质细胞的转录组数据也揭示了TGF-β信号通路的信号成分的有趣表达模式与来自分选的小胶质细胞和星形胶质细胞的qRT-PCR数据(补充图13D)一致，数据显示在星形胶质细胞-Tgfb1 KO(图3和补充图6-8)后检测的标记物中没有可观察到的形态学或免疫组织化学变化，RNA-seq数据显示，与星形胶质细胞相比，小胶质细胞中的Tgfb1、Tgfbr1、Tgfbr2和Lrrc33(一种潜伏的TGF-β1配体激活所必需的蛋白质)都显著富集(补充图18或补充数据2)。此外，作者观察到Smad3和Tgfbr1的下调，而不是Tgfbr2 mRNA的下调，表明Smad3和Tgfbr1表达的TGF-β信号依赖性前馈调节(图7B和补充图18)。由于作者的批量RNAseq分析使用了混合的雌性和雄性样本， 他们进一步验证了来自雌性和雄性WT和MG-Tgfb1 iKO小鼠的额外独立队列的分选小胶质细胞中的几个关键差异表达基因。来自分选的小胶质细胞的qRT-PCR数据证实，在雌性或雄性Tgfb1 iKO小鼠中，作者在所有检测的基因(上调和下调的DEGs)中没有观察到性别差异(补充图19)。

     作者团队接下来研究了MG-Tgfb1 iKO小鼠中DAM相关和年龄相关小胶质细胞的特征以及这些小鼠中反应性星形胶质细胞的存在是否会影响年轻成年小鼠的神经功能。在本实验中使用了全剂量的TAM，以实现成年小鼠脑中小胶质细胞和星形胶质细胞的最大变化(在行为测试中使用了雌性和雄性)。在TAM注射后5周，首先使用自动开阔视野运动跟踪系统评估对照组和MG-Tgfb1 iKO小鼠的自主运动，并在小鼠自由获得食物和水的情况下监测小鼠23小时。与Cx3cr1^CreERTgfb1^wt/wt+TAM对照组相比，Cx3cr1^CreERTgfb1^fl/fl+TAM组动物在探索阶段(初次暴露于该室后1小时)或在光照或黑暗周期(图8K–N)中未观察到任何一般运动变化。接下来，作者进行了加速旋转棒测试来评估运动协调和运动学习以评估他们的启动运动协调性，以及他们的性能在每次试验中如何提高。与对照组Cx3cr1^CreERTgfb1^wt/wt+TAM组相比，Cx3cr1^CreERTgfb1^fl/fl+TAM组动物在旋转棒试验中的表现没有差异(图8O)，表明在基因缺失后的这个时间点，MG-Tgfb1 iKO小鼠的运动协调和运动学习没有受到影响。然而，当作者使用2天Barnes迷宫学习范式评估对照组和MG-Tgfb1 iKO小鼠的认知功能(空间学习/记忆)时，Cx3cr1^CreERTgfb1^fl/fl TAM组显示，与对照组小鼠相比，到达逃脱洞的潜伏期增加，定位洞的错误尝试次数增加(图8P–R)，表明Cx3cr1^CreERTgfb1^fl/fl iKO小鼠的空间学习受损。重要的是，在上述任何行为测试中，接受载体治疗的Cx3cr1^CreERTgfb1^fl/fl小鼠与对照小鼠相比没有表现出任何差异(图8C-J)，证明Cx3cr1^CreERTgfb1^fl/fl+TAM小鼠在Barnes迷宫中测量的认知功能行为缺陷是由TAM诱导的这些小鼠的小胶质-Tgfb1基因缺失特异性引起的。这些数据支持小胶质细胞来源的TGF-β1配体在维持小胶质细胞稳态、星形胶质细胞静止和正常的认知功能。作者团队没有观察到雌性和雄性小鼠在任何基因型上的显著差异。

      作者团队接下来研究了在成年MG-Tgfb1 iKO小鼠中是否也观察到了类似的表型(TAM给药于年轻的成年小鼠6-10周龄)。与成年MG-Tgfb1 iKO小鼠缺乏主要运动缺陷一致，作者没有观察到少突胶质细胞转录因子2 (OLIGO2+)、神经元-神经胶质抗原2 (NG2+)或CC1+细胞数量的任何显著差异和皮质区域中髓鞘碱性蛋白(MBP)水平(补充图20)。类似地，在TAM后12周(小胶质细胞和星形胶质细胞激活持续的时间点，如图1所示)，MG-Tgfb1 iKO小鼠的皮质层中SST+或PV+中间神经元的数量或分布没有差异(补充图20)。此外，在TAM后12周的MG-Tgfb1 iKO小鼠的对照之间，在皮层体感区的所有皮层中的总NeuN+神经元群体没有差异(补充图20)。这些数据表明，与发育阶段中Tgfb1配体或受体的组成性或整体性缺失不同，Tgfb1基因切除对成体少突胶质细胞谱系、总神经元存活或皮质中间神经元群体的影响较小。该数据还表明，观察到的认知缺陷可能是由于iKO小鼠神经元中更细微的结构或功能变化。由于涉及神经元-小胶质细胞通讯(P2RY12，CX3CR1)的多个基因和小胶质细胞吞噬功能所需的受体(P2RY12，MER原癌基因酪氨酸激酶-MerTK和髓样细胞表达的触发受体2-TREM258)的下调，接下来作者团队假设在MG-Tgfb1配体敲除小鼠中突触修剪可能减少。为了便于树突棘密度的测量，在WT或iKO小鼠中使用经眶后递送的系统性腺相关病毒(AAV)载体用明亮的单体荧光蛋白mGreenLantern(一种明亮的单体荧光蛋白)稀疏地标记神经元(图8S)。鉴于海马在学习和记忆中的已知作用以及在iKO小鼠中观察到的认知缺陷，作者分析了mGreenLatern阳性的CA1锥体神经元的基底树突的树突棘密度(图8T)。结果显示MG-Tgfb1 iKO小鼠的CA1神经元中棘密度增加(图8U，V)，与观察到的Tgfb1 KO小胶质细胞中TREM2和MerTK受体的下调一致。

图8 行为评估显示，年轻成年Cx3cr1^CreERTgfb1^fl/fl iKO小鼠的一般运动功能和运动学习正常，但空间学习和记忆有缺陷，海马CA1神经元的树突棘密度增加

      由于多项研究表明在衰老或疾病脑中TGF-β信号传导总体降低，因此小胶质细胞中受损的TGF-β信号传导是否会影响这些情况下重新增殖的小胶质细胞尚不清楚。作者团队测试了MG-Tgfb1或MG-Alk5缺失是否会影响成年脑中小胶质细胞在药物消融后的再增殖，作者的数据支持虽然TGF-β信号传导的消除不能阻止PLX5622治疗后CNS中小胶质细胞的再增殖，当通过小胶质细胞特异性配体敲除（MG-Tgfb1 iKO）或受体敲除（MG-Alk5 iKO）使小胶质细胞中的TGF-β信号转导沉默时，在重新增殖的小胶质细胞中未达到稳态。在缺乏小胶质细胞来源的TGF-β1配体或ALK5受体缺失的情况下，小胶质细胞过度填充大脑（图9A-D，H），并且重新填充的小胶质细胞显示活化的形态学。（图9 E，F）并且缺乏稳态小胶质细胞特征基因表达重要的是，稳态异常Tgfb1或Alk5敲除小胶质细胞的再增殖也导致星形胶质细胞的活化这表明在TGF-β信号传导减弱的疾病背景下小胶质细胞群体的再增殖/重置可能导致非稳态小胶质细胞的再增殖，并且可能不是理想的策略。

图9 PLX5622消融后，稳态小胶质细胞的再增殖需要通过小胶质细胞衍生的TGF-β1配体或ALK5依赖性信号传导的TGF-β信号传导

      进一步了解TGF-β1信号在大脑中的精确调节可以为小胶质细胞在稳态和疾病状态下的功能提供重要的见解。作者团队的研究填补了对CNS TGF-β配体产生和调节的认识中的几个空白，并阐明了单个细胞因子基因（Tgfb 1）的改变如何影响小胶质细胞的功能。在没有脑损伤或其他引起疾病的应激源的情况下，小胶质细胞中的蛋白质可能会导致年轻成年小鼠的认知缺陷。

      总之，结果可能对小胶质细胞-TGF-β1信号在衰老、神经退行性疾病或中枢神经系统损伤后观察到的认知缺陷中的作用有重要意义。虽然恒定的基础TGF-β1信号是小胶质细胞稳态所必需的，但TGF-β1水平会随着衰老、损伤和疾病而变化。结果支持TGF-β1配体缺失导致的小胶质细胞失调导致类似DAMs和老化小胶质细胞的转录特征。这可能在驱动疾病条件下观察到的认知缺陷中起因果作用，并且靶向TGF-β信号可能是减轻这些缺陷的潜在治疗策略。

精读文献请下载原文：

Bedolla A, Wegman E, Weed M, et al. Adult microglial TGFβ1 is required for microglia homeostasis via an autocrine mechanism to maintain cognitive function in mice. Nat Commun. 2024 Jun 21;15(1):5306.