分享两篇chaperone有关的分子设计。第一篇发表于2004年，是来自Howard Hughes Medical Institute的Isabella A. Graef的论文[1]。
在这篇工作中，双功能分子的一端与FK506结合蛋白（FKBP）结合（FKBP在所有哺乳动物细胞中高表达），双功能分子的另一端可以自由地与聚集的Aβ相互作用。许多有机化合物，包括刚果红（Congo Red, CR），都是淀粉样蛋白的配体，但这些化合物并不适合临床治疗。为了研究是否可以通过招募chaperone来增强这些原本无效的小分子干扰Aβ聚集的能力，作者合成了SLF-CR（图2），它由刚果红与FKBP的配体SLF通过共价键连接而成。
SLF-CR/FKBP（10 μM）完全阻断了能够散射光的Aβ聚集体的形成。在纳摩尔浓度下，SLF-CR/FKBP也可以延迟淀粉样蛋白聚集。SLF-CR的抑制需要FKBP，但单独的FKBP并没有改变Aβ的聚集。相反，CR是一种适度的浊度抑制剂，FKBP不会改变其效力。作者还通过硫黄素T测定法表征了SLF-CR对Aβ的聚集的影响。硫黄素T荧光在Aβ聚集体存在时增加。SLF-CR/FKBP降低硫黄素T结合物种浓度的IC50比CR/FKBP低约5倍。增加FKBP的摩尔当量进一步增强了SLF-CR的效力。在没有FKBP的情况下，SLF-CR和CR具有相似的活性。这些结果表明，药物介导的FKBP的募集是增强效力所必需的。
显微镜下观察到SLF-CR阻断了Aβ纤维形成（图3）。AFM结果显示，在SLF-CR/FKBP处理后的样品中观察到更小、更少伸长的物种；这些可能是在原纤维形成之前的中间体，这些颗粒大小大致均一，表明SLF-CR/FKBP在聚集途径中的一个独立的步骤中断了原纤维的形成；而在用CR/FKBP处理的样品中没有观察到这些物种，所以它们可能表明CR和SLF-CR/FKBP的作用机制的不同。此外，Aβ低聚物的电泳分析显示，在用SLF-CR/FKBP处理的Aβ样品中，小聚集体占主导地位。
图4 （A）链长对活性影响的机制；（B）不同连接链的化合物结构C不同化合物对硫黄素T荧光的影响D不同化合物对纤维形成的抑制
活性最好的化合物是SLF-Benz-CR/FKBP，IC50约50 nM，比CR低40倍，并且比SLF-CR/FKBP提高6倍。TEM结果表明，不同的双功能分子处理的样品中，Aβ中间体的大小和形状相似。因此，无论Linker的性质如何，都会形成一种常见的FKBP-drug-Aβ复合物。
第二篇发表于2023年，由Revolution Medicines公司和Memorial Sloan Kettering Cancer Center的研究人员共同发表[2]。
——背景——
背景：KRAS是一种小的鸟苷三磷酸酶（GTPase），是传统的难靶蛋白（尽管已有针对KRAS G12C抑制剂）。KRAS在非活性[鸟苷二磷酸（GDP）结合，OFF]状态和活性（GTP结合，ON）状态之间循环。活性KRAS结合并激活几种效应蛋白以调节细胞生长和增殖。KRAS突变作为致癌驱动因素，刺激过度的下游信号传导和增殖。KRAS G12C是非小细胞肺癌中最常见的KRAS突变，37%至43%的携带该变体的NSCLC患者对针对KRAS G12C非活性状态的抑制剂（如索托拉西布和阿达格拉西布）的治疗有反应。然而，两者在反应的深度和持续时间方面都是有限的。尽管这种限制的原因是多因素的，但癌症细胞似乎通过增加药物敏感性、GTP-结合的KRAS G12C的量来绕过非活性状态-选择性抑制。
——方法——
本文提出的解决思路：雷帕霉素和FK506等天然产物可以与免疫亲和蛋白FKBP12结合，分别抑制mTOR或钙调神经磷酸酶。[雷帕霉素并不直接抑制mTOR 活性，它与FK506结合蛋白12(FKBP12)结合形成FKBP12-雷帕霉素复合物，该复合物再结合mTOR的FRB结构域，其中，雷帕霉素嵌入由 FKBP12 和 mTOR 的 FRB 结构域形成的空腔中，改变mTOR的构象，从而以变构的方式抑制mTORC1活性。因此FKBP12只是雷帕霉素介导的 mTORC1 抑制的辅助因子。由于 FRB 结构域是mTOR独有的，因此雷帕霉素对mTOR具有极好的选择性并且在纳摩尔范围内有效。雷帕霉素的衍生物的作用机制与雷帕霉素类似[3]。
受此启发，作者使用了基于结构的方法重新设计了一种双功能配体，该配体可形成免疫亲和蛋白：配体：KRAS活性态三元复合物，抑制KRAS与下游靶蛋白结合，从而阻止癌症的发生发展。——结果——
第一个问题就是免疫亲和蛋白的选择。FKBP12是一个常用蛋白，配体也很成熟。但作者通过分析cyclophilin A (CYPA)与其配体结合的界面发现，该界面与KRAS效应结合界面上的残基具有良好的静电表面电荷互补性，而FKBP12不具备这一特征（图5）。因此本文选择了CYPA。
图5 三个蛋白的表面静电势
通过分析CYPA 的binder Sanglifehrin A（图6），将其中与CYPA结合贡献大的片段（蓝色部分）与一个Cys共价反应头组合，得到了初始化合物Compound-1，并且拿到了CYPA: Compound-1:KRAS G12C三元复合物的晶体结构。初步证明了该设想的可行性。接着通过一系列改进，优化得到了RMC-4998（图7）。
图6 Sanglifehrin A的结构式
图7 小分子结构改造的结构
图8 （A）CYPA: Compound-1:KRAS G12C三元复合物结构；（B）CYPA: RMC-4998:KRAS G12C三元复合物结构
通过这些相互作用，RMC-4998重塑了CYPA的分子表面，以产生对KRAS G12C具有亲和力的新形态界面，同时，三元复合体的晶体结构揭示了实现稳定结合的几个关键相互作用。
图9 （A-C）CYPA: RMC-4998:KRAS G12C与KRAS靶蛋白二聚体的叠合；（D）随着RMC-4998浓度上升，KRAS与下游靶蛋白解离增加
最后，作者们进行了对RMC-4998进行了一系列抗肿瘤活性评价。目前该类化合物正在临床试验中。
——结果——
3. 最后就是第一篇做到细胞实验层面就停止了，而第二篇的化合物已经进入了临床实验。
4. 第一篇只有三位作者，第二篇有三十六位作者。总的看下来，第二篇比第一篇细致了很多，走的也更远，将核心想法做的更完善。在PROTAC大火的当下，希望这类双功能分子也能真正地解决实际问题。同时再次感叹，天然产物总能给药物发现提供新的惊喜。参考文献：
[2] Christopher J. Schulze et al. ,Chemical remodeling of a cellular chaperone to target the active state of mutant KRAS.Science381,794-799(2023). DOI:10.1126/science.adg9652
