“神药”小檗碱 | 抑制结直肠肿瘤的作用机制

小檗碱是生活中一味常用药，名字乍一听好像很陌生，但实际上他有一个别名叫做“黄连素”。黄连素就耳熟很多了是吧？黄连素，顾名思义就是从黄连里面提取的一种物质，他是黄连抗菌效果的主要成分。在我国，早在秦汉时期，人们便用黄连来治疗由细菌感染而引起的肠胃疾病，效果非常显著。

但是现今研究发现，黄连素的功效不仅仅在于此，他被称之为“神药”虽然有些夸大其词，但他确实在很多区域都有所应用。除了有抑菌作用外，在降血糖、降血脂、改善心律失常、降低心血管疾病风险，改善阿尔兹海默症以及预防癌症方面，都有一定的作用。

今天给大家分享的这篇文章发表于phytomedicine（IF=7.9）上，名为“Berberine regulates short-chain fatty acid metabolism and alleviates the colitis-associated colorectal tumorigenesis through remodeling intestinal flora”。结肠炎相关肠癌 (Colitis-associated colorectal tumor，CAC) 是炎性肠病的并发症。据报道肠道微生物群可以介导免疫炎症反应，人们认为是由肠道微生物群组成的变化引起的微生物群失调是诱导CAC发展的重要因素。有益细菌可能通过参与糖酵解和丁酸代谢抑制CAC的进展。临床发现小檗碱能够有效的抑制结直肠腺瘤的产生，但小檗碱抑制结直肠肿瘤的作用机制有待发掘。

研究背景  

1. 结肠炎相关肠癌(CAC)是炎性肠病的并发症。据报道肠道菌群作为CAC过程中的重要因素，可能是改善CAC治疗的新途径。

2. 小檗碱，又名黄连素，一种异喹啉生物碱，临床发现小檗碱能减少结直肠腺瘤发生，抑制结直肠癌变。

小檗碱在抑制结直肠肿瘤的作用机制有待发掘，本研究旨在探讨小檗碱如何通过影响CAC小鼠肠道菌群从而抑制结肠炎相关肠癌。

研究思路  

研究思路

1. 首先，作者发现小檗碱可以治疗肠炎，并且在临床上对肠癌有良好的影响作用；

2. 然后，作者通过测定肠道微生物来推断其功能，发现小檗碱影响下增加的菌群与短链脂肪酸代谢有关；

3. 接着，作者通过测定代谢物以及受到影响后的肠壁和信号通路的变化，来推断小檗碱通过影响肠道菌群来抑制结直肠肿瘤的发生；

4. 最后，作者进行了肠道菌群移植AOM/DSS小鼠的实验来重复验证结果的可靠性。

研究过程与结果  

1. 小檗碱抑制小鼠结直肠肿瘤的发生

将实验小鼠分为五组，第一组为空白对照，不做任何处理，其他四组均使用AOM/DSS诱导。第三组口服少量的小檗碱，第四组增加用量，第五组用阿司匹林代替作为阳性对照。用量来源于临床数据，具有可靠性。12周后处死小鼠，对结直肠组织进行观察。可以看出，空白对照小鼠中无直肠癌肿瘤，经过AOM/DSS处理但并没有投喂小檗碱和阿司匹林的小鼠作为对照可以看出发病面积、统计得出的肿瘤数量和负荷都较高，投喂相同剂量的小檗碱和阿司匹林的小鼠组可以看出发病情况皆有所减轻且二者情况相近。而加大小檗碱剂量的小鼠组发病情况最轻，肿瘤数量和负荷相对最低（图1B-D）。从Ki-67阳性细胞的数目也可以看出同样的趋势（图1E,F），由此可见，小檗碱确实能够抑制小鼠结直肠肿瘤的发生。

2. 小檗碱调节小鼠肠道微生物群  

检测了小檗碱处理的实验组肠道微生物群多样性（图2A） ，相比于对照组，AOM/DSS组细菌多样性显著降低，而AOM/DSS+小檗碱组的细菌多样性上调接近对照组。测定了细菌们的相对丰度水平（图2B），可以看出小檗碱调节了F/B的比率，也就是对有害菌有抑制作用，对有益菌有相对上调作用。

另外进行了LEfSe分析，得到LDA值分布柱状图，展示了LDA score大于设定值有差异的物种，即不同组中丰度有显著差异的物种，柱状图的长度代表显著差异物种的影响大小。图3A是正常组和AOM/DSS组的菌群丰度差异，图3B是AOM/DSS组和小檗碱投喂组的菌群丰度差异。可以看出，AOM/DSS组中的优势菌群主要是内脏臭气杆菌等与炎症有关的有害菌，AOM/DSS+小檗碱组主要是普氏菌科细菌等，其中大多数与短链脂肪酸代谢有关。可以得出，小檗碱对AOM小鼠的肠道微生物起到了调节作用，且可能诱导了短链脂肪酸的代谢途径。

3. 小檗碱调节小鼠相关的代谢产物来抑制肿瘤的发生

肠道微生物群的结果指向了短链脂肪酸代谢途径，所以作者分析了短链脂肪酸代谢组学，结果显示（图4A），相对于空白对照组，AOM/DSS处理的小鼠组丁酸、乙酸和丙酸含量较低，而AOM/DSS加小檗碱处理的小鼠组丁酸、乙酸和丙酸含量较高，但异丁酸、异戊酸、戊酸和己酸的水平不受到影响，丁酸、乙酸和丙酸是由碳水化合物发酵而成的，而异丁酸、异戊酸、戊酸是由蛋白质发酵而成。此外，喂食小檗碱减少了小鼠血清LPS的含量（图4B）。可以得出，小檗碱可能通过调节小鼠相关的糖酵解代谢产物来抑制肿瘤的发生。

4. 小檗碱上调肠屏障功能蛋白的表达和抑制炎症-癌转化通路的激活

为探究小檗碱对肠道屏障的影响，进行了免疫组化染色实验（图5A,B），结果显示Occludin和ZO-1两种蛋白的含量在AOM组小鼠肠上皮组织中的表达明显降低，而在AOM+小檗碱组小鼠肠道上皮组织中的表达明显升高。这两种蛋白皆为紧密连接蛋白，用于维护细胞的紧密连接，含量降低表示屏障受损。小檗碱提高了这两种蛋白的表达量，表明小檗碱可以抑制肠道屏障的破坏。

图5C的免疫荧光染色显示，与正常组相比，AOM/DSS组小鼠肠道IL-6和p-STAT3的表达明显增强，而小檗碱诱导的IL-6和p-STAT3的表达明显抑制。Western blot结果显示（图5D-H），AOM组的TLR4、P65、IL-6、p-STAT3的表达皆明显升高，而摄入小檗碱抑制了这些表达。这些皆为TLR4/NF-kb通路重要的调节因子，所以可以得出结论，小檗碱抑制了TLR4/NF-kb炎症-癌症转化通路的激活。

5. 菌群移植抑制小鼠结肠炎相关结直肠肿瘤的发生

下面进行肠道菌群移植（FMT）以重复验证小檗碱影响下肠道菌群对小鼠结肠炎相关结直肠肿瘤的作用，将AOM/DSS小鼠和AOM/DSS+小檗碱的小鼠的粪便菌群移植到新的AOM/DSS处理的小鼠肠道中，可以看出，与空白对照组相比，菌群移植摄入小檗碱的小鼠组较不摄入的小鼠组发病情况较轻，肿瘤数目和负荷皆较低（图6B-D）。

Ki-67染色结果显示（图E,F），与空白对照组相比，FMT摄入小檗碱的小鼠组较不摄入的小鼠组Ki-67阳性细胞数较少，FMT摄入小檗碱的小鼠组结直肠组织细胞的增殖被显著抑制。

这些都表明菌群移植可以抑制小鼠结肠炎相关结直肠肿瘤的发生。

6. 菌群移植调节相关的代谢产物来抑制肿瘤的发生

同样，短链脂肪酸代谢组学结果显示（图7A），移植小檗碱饲喂小鼠菌群上调了小鼠粪便丁酸、乙酸和丙酸的含量，异丁酸、异戊酸、戊酸和己酸的水平不受到影响。且下调了肿瘤小鼠LPS的含量（图7B）。这与供体的实验结果相一致。

7. 菌群移植调节肠屏障功能蛋白的表达和炎症-癌转化通路的激活

在对肠道屏障的影响方面，进行了免疫组化染色实验（图8A,B），结果显示Occludin和ZO-1两种蛋白的含量在FMT不摄入小檗碱小鼠组肠上皮组织中的表达明显降低，而在FMT摄入小檗碱的小鼠组肠道上皮组织中的表达明显升高。表明移植小檗碱饲喂菌群可以通过调节肠道屏障功能蛋白来抑制肠道屏障的破坏。

免疫荧光染色显示（图8C），与正常组相比，FMT不摄入小檗碱小鼠组肠道IL-6和p-STAT3的表达明显增强，而FMT摄入小檗碱小鼠组的IL-6和p-STAT3的表达明显抑制。Western blot结果显示（图8D-H），FMT不摄入小檗碱小鼠组TLR4、P65、IL-6、p-STAT3的表达明显升高，而摄入小檗碱组的这些表达被抑制。可以得出结论，摄入小檗碱的小鼠菌群移植同样抑制了TLR4/NF-kb炎症-癌症转化通路的激活。

研究总结  

文章总结为如下的一张图（图9）。左边是患有结肠炎相关结直肠肿瘤的小鼠的情况，可以看出，有害菌群的含量增高而有益菌群的含量降低，LPS含量的上升，SCFA短链脂肪酸的含量下降，LSP含量的上升激活了TLR4，进一步诱导NF-kb、iL-6和STAT3，激活TLR4/NF-kb信号通路。紧密连接蛋白含量下降，肠壁屏障损坏。

相对的，小檗碱影响下，有害菌群的含量降低而有益菌群的含量降低，短链脂肪酸的含量上升，LSP含量降低，短链脂肪酸的含量上升下调了TLR4，进一步降低NF-kb、iL-6和STAT3的含量，抑制了TLR4/NF-kb信号通路。紧密连接蛋白含量上升，肠壁屏障修复。

小檗碱通过三个平衡水平抑制结肠炎相关结直肠肿瘤的发生：（1）病原菌和有益菌；（2）肠道菌群代谢的短链脂肪酸和LPS；（3）TLR4/NF-kB炎症-癌症转化信号和肠道屏障功能。