这是一篇在2024年12月20日发表在Cell & Bioscience[IF: Q1/6.1]杂志上的文章《Single-cell multi-omics analysis reveals candidate therapeutic drugs and key transcription factor specifcally for the mesenchymal subtype of glioblastoma》
（DOI:10.1186/s13578-024-01332-3)
本文公式：单细胞转录组数据整合 + MES亚型鉴定 + hdWGCNA共表达网络分析 + 药物敏感性预测 + 核心基因模块筛选(38个基因) + 表观遗传调控网络分析 + 实验验证(CEBPG功能验证)
研究背景：肿瘤细胞固有的异质性阻碍了针对特定胶质母细胞瘤（GBM）亚型的靶向治疗的发展。本研究旨在研究GBM的间充质亚型，以揭示GBM的详细特征，潜在的治疗策略，并提高GBM患者的精确治疗。研究团队整合了单细胞RNA测序（scRNA-seq）、转座酶可及染色质测序的单核测定（snATAC-seq）和批量RNA测序数据集，以鉴定核心基因模块、候选治疗药物和间充质亚型GBM肿瘤细胞特异性的关键转录因子，研究团队在体外和人体样本中验证了这些基因模块、候选治疗药物和关键转录因子。研究团队的分析包括来自肿瘤和邻近正常组织的55，845个细胞的异质单细胞景观，重点是间充质亚型的不良预后及其与缺氧的相关性。研究团队确定了一个由38个基因组成的核心基因模块，并通过药物基因组学分析发现，曲美替尼和达沙替尼对间充质亚型GBM细胞的有效性增加。此外，通过整合snATAC-seq数据，研究团队描绘了一个重要的调控网络，并确定了关键的转录因子CEBPG。研究团队的研究强调了GBM的间充质样（MES样）特性与缺氧之间的密切联系，为候选药物和精确治疗间充质亚型的关键靶点提供了有价值的见解。
Figure1 GBM样本中的缺氧状态与间充质亚型的危险因素相关
通过对TCGA-GBM样本进行单样本基因集富集分析(ssGSEA)，研究发现无论使用何种基因集，TCGA_Mes亚型、MES1_like_GBM、MES2_like_GBM均为显著高风险因素，这一结果在CGGA325和CGGA693队列中得到验证。进一步将样本按中位评分分为高低两组进行生存分析，结果显示间充质亚型与较差预后显著相关。此外，TCGA-GBM和CGGA-GBM队列中的表型相关性分析揭示间充质亚型与缺氧之间存在显著正相关，提示此亚型是所有GBM亚型中风险最高的类型。研究表明，GBM的组织缺氧特征是促使癌细胞向健康组织扩散以逃避不利微环境的关键因素。(图1A展示了TCGA-GBM中Cox回归分析结果；图1B显示了CGGA-GBM的相应分析；图1C-F为基于两个不同MES亚型基因集的生存分析曲线；图1G-J展示了MES相关富集评分与HALLMARK_HYPOXIA和Nature_metabolism_hypoxia基因集富集评分的相关性分析)。
Figure2 确定MES样恶性细胞的肿瘤演变和缺氧特异性
研究通过整合三个已有数据集的单细胞RNA测序数据，分析了来自11个GBM样本的55,845个细胞。通过与正常少突胶质细胞比较，基于7号染色体扩增和10号染色体缺失特征鉴定了恶性肿瘤细胞。轨迹分析显示细胞从OPC样和NPC样逐渐向AC样和MES样转化，且MES样细胞的转化最为显著，表明其为GBM发育的终末阶段。使用缺氧基因集分析发现，间充质亚型中超过50%的细胞处于缺氧状态，而其他亚型中缺氧细胞比例不足50%。相关性分析进一步揭示各样本中缺氧细胞比例与MES样细胞比例呈强正相关，而与OPC样、NPC样和AC样细胞呈负相关，提示细胞缺氧状态在GBM进展过程中主要发生于MES亚型。(图2A为单细胞数据UMAP图；图2B显示拷贝数变异分析；图2C为各细胞类型标记基因表达；图2D展示假时序分析结果；图2E为CytoTRACE评分箱线图；图2F-G显示不同细胞类型中缺氧细胞分布；图2H为各样本细胞构成；图2I展示缺氧细胞与MES样细胞比例相关性)。
Figure3 MES样细胞中核心有害基因集的鉴定
研究采用高维加权基因相关网络分析(hdWGCNA)来研究MES样GBM细胞的关键基因网络。在软阈值为10的条件下构建了共表达矩阵，最终确定了16个表达模块。通过UCell评估和差异分析发现，模块1在MES样细胞中表现出显著特异性。进一步对模块1内的基因进行单变量分析(危险率>1，p<0.05)和PPI分析，最终鉴定出38个有害基因组成的核心模块，其中QSOX1、ARPC1A、DERL2、CNPY4和EFEMP2为最显著的5个基因。(图3A展示基于最小软功率阈值的无标度拓扑模型；图3B显示基因聚类树和网络模块；图3C为使用UCell算法计算的模块得分；图3D为四种肿瘤细胞亚型的差异模块火山图；图3E展示模块1中重要基因；图3F左图为经PPI分析和单变量Cox回归筛选后的基因网络，右图为各基因的单变量Cox回归森林图)。
Figure4 M1模块特异性表达细胞与肿瘤微环境之间的相互作用
研究通过GO富集分析发现模块1基因主要富集于细胞外基质和缺氧相关通路。使用xCell和ssGSEA算法分析发现，模块1评分与巨噬细胞浸润呈显著正相关。在细胞水平上，该模块基因在周细胞、BMDM和MES样细胞中高表达。将肿瘤细胞按M1评分分为高低两组后，发现M1高表达组与微环境的通讯更为活跃，特别是通过ANXA1-FPR1、TGFβ1-TGFβR等轴与小胶质细胞、BMDMs和基质细胞发生相互作用。(图4A显示模块1中38个核心基因的GO富集分析结果；图4B-C展示M1评分与巨噬细胞xCell评分的相关性；图4D为M1基因集富集评分在UMAP上的分布；图4E为各细胞类型的M1基因集富集评分箱线图；图4F为M1高低表达肿瘤细胞与其他细胞类型的互作网络；图4G-H为不同配体-受体对在细胞间的互作强度气泡图)。
Figure5 潜在的MES样GBM特异性治疗药物：曲美替尼和达沙替尼
研究通过药物筛选寻找针对MES样GBM的特异性治疗方案。采用岭回归分析预测药物敏感性，将细胞按M1表达分为高低两组进行比较。筛选标准为：IC50与M1评分相关性<-0.1且log2FC(IC50)<0。从GDSC2数据库的198种药物中，最终筛选出12种对M1高表达组显示较低IC50值的候选药物。通过Beyondcell分析发现Dasatinib、Brefeldin A、BMS-536924、Trametinib和SCH772984对M1高表达组最为敏感，其中Dasatinib和Trametinib在之前预测的13种药物中也有出现。Bcscore分析进一步验证了这两种药物对MES样GBM细胞的特异性敏感性。(图5A左图为满足筛选标准的药物Venn图，右图为药物IC50与M1评分相关性散点图；图5B为13种药物在M1高低组的IC50箱线图；图5C为按M1高低分组的肿瘤细胞Beyondcell UMAP图；图5D为M1高组细胞的药物敏感性散点图；图5E-F为细胞对Dasatinib和Trametinib敏感性的UMAP分布；图5G-H为4种肿瘤细胞亚型的bc评分分布直方图)。
Figure6MES样GBM细胞特异性的基因调控网络
研究通过SCENIC分析探索MES样GBM细胞的特异性基因调控网络。分析将细胞分为9个调控模块(RM)，每个模块由特定转录因子代表。在M1高表达组中，RM5和RM8模块活性升高，其中RM8在MES样细胞中表现出较强的特异性。基于SCENIC分析结果构建了由13个关键转录因子组成的间质亚型调控网络。方差分解分析显示转录因子CEBPG对间质亚型具有显著的特异性贡献。(图6A为恶性细胞中9个转录因子调控模块的分布；图6B为9个调控模块的代表性转录因子及其结合模序；图6C为M1高低组中9个调控模块活性的UMAP分布；图6D为4种GBM细胞亚型中9个调控模块的活性评分；图6E为调控模块8中转录因子和靶基因的网络图；图6F为调控模块8中11个转录因子在4种GBM肿瘤亚型中的方差贡献分解结果)。
Figure7转录因子CEBPG对MES样细胞的重要和特异性调节
研究通过Lasso回归分析从模块1中选择了9个关键基因，分析它们的上下游序列后发现6个基因与转录因子CEBPG结合位点匹配。CEBPG是位于19号染色体上的CCAAT/增强子结合蛋白，在多种癌症中上调表达，尤其在GBM中表达显著。实验验证显示：1. qRT-PCR分析证实CEBPG在GBM细胞系(U87-MG和U118-MG)中显著高于正常星形胶质细胞2. HPA数据库的免疫组化结果支持这一发现3. 分析snATAC-seq数据发现两个CEBPG结合模序在MES样细胞中显著富集，且tn5富集峰最高.这些多组学证据共同支持CEBPG是MES样GBM细胞的关键特异性转录因子。(图7A-B为Lasso回归分析确定9个M1相关风险基因；图7C为CEBPG在正常人星形胶质细胞和GBM细胞系中的qPCR表达结果；图7D为HPA数据库中CEBPG在正常皮质组织、低级别和高级别胶质瘤的免疫组化结果；图7E为整合的snATAC-seq数据UMAP图；图7F为CEBPG两个结合模序在GBM细胞中的功能活性；图7G为两个结合模序在4个GBM亚组中的富集评分箱线图；图7H为4种GBM细胞亚型中CEBPG的tn5插入富集评分基因组足迹图)。
Figure8CEBPG在GBM细胞活力、迁移和缺氧反应中的功能分析
研究通过多个实验验证了CEBPG在GBM中的功能：1.基因特征分析显示CEBPG与缺氧、EMT、侵袭、转移和分化相关特征呈显著正相关。2.细胞系验证：- 选择MES标记物(ADM和ANGPTL4)高表达的U87-MG和U118-MG细胞系- U118-MG表现出更显著的MES特征 3.CEBPG功能实验：- siRNA敲低实验表明三个siCEBPG均有效，选择最有效的siCEBPG-1- CCK-8实验显示敲低CEBPG后细胞活力降低- 伤口愈合和transwell实验证实CEBPG敲低抑制细胞迁移和侵袭- 流式细胞术显示CEBPG敲低增加细胞凋亡- 集落形成实验表明CEBPG敲低抑制细胞致瘤性，在低氧条件下效果更显著这些结果证实CEBPG通过增强细胞对低氧的耐受性促进GBM发展。(图8A为U87-MG和U118-MG中si-CEBPG的敲低效率；图8B为敲低后0-72h的细胞活力；图8C为伤口愈合实验结果；图8D为transwell侵袭实验结果；图8E为细胞凋亡分析；图8F为常氧和低氧条件下的集落形成实验结果)。
本文亮点：
1. 系统鉴定MES亚型特征：
- 通过整合多组学数据(scRNA-seq、snATAC-seq和bulk RNA-seq)
- 确定了38个基因组成的核心共表达模块
- 揭示MES亚型与肿瘤缺氧的密切关系
2. 发现潜在治疗药物：
- 通过单细胞药物基因组学分析筛选药物
- 鉴定出Trametinib和Dasatinib对MES亚型GBM细胞具有特异性抑制效果
- 这两种药物已获FDA批准，具有临床转化价值
3. 确定关键调控因子CEBPG：
- 通过多维度分析确定CEBPG是MES亚型的特异性转录因子
- 实验验证CEBPG促进GBM细胞增殖、迁移和侵袭
- 发现CEBPG在低氧条件下的重要作用
4. 创新性：
- 首次系统揭示GBM间叶亚型的分子特征
- 建立了基于单细胞水平的药物筛选策略
- 提供了针对MES亚型的精准治疗新思路
这些发现为改善GBM患者，特别是预后较差的MES亚型患者的治疗提供了新的靶点和策略。
写在最后：本研究通过单细胞层面的系统分析，揭示了GBM中MES亚型的分子特征与生物学机制。研究团队基于多组学数据整合，识别出一个38基因组成的核心模块，并通过药物基因组学分析筛选出两个潜在的治疗药物。特别是通过整合epigenetic数据，发现了CEBPG作为MES亚型特异性的关键转录因子。研究不仅在多个独立队列中验证了发现的分子标志物，还通过体外实验和人源样本验证了其生物学功能，展示了较强的转化应用潜力。这项工作为GBM的精准治疗提供了新的策略和方向，也为肿瘤异质性研究提供了重要的分析范式。
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