《Erythropoietin promotes abdominal aortic aneurysms in mice through angiogenesis and inflammatory infiltration》这篇文章于2021年4月21日发表在《science translational medicine》，由山东大学齐鲁医院心内科张运院士、张澄教授担任该论文的共同通讯作者。
https://www.science.org/doi/10.1126/scitranslmed.aaz4959?url_ver=Z39.88-2003&rfr_id=ori:rid:crossref.org&rfr_dat=cr_pub%20%200pubmed
前言：
腹主动脉瘤（AAA）是一种可能致命的血管疾病，其特点是腹主动脉的局部扩张，直径超过3厘米或较正常直径增大50%以上。AAA患者通常无明显症状，直到动脉破裂，而一旦破裂，死亡率高达85%至90%。目前尚无有效的临床预测因子或药物能够降低AAA发生的风险或阻止其进展。
腹主动脉瘤（AAA）的动物造模方法多样，主要包括遗传、化学、手术和生物因素等模型。每种模型都有其特定的优缺点，以下是常用的AAA造模方法及其详细优缺点：
| 造模方法 | 主要特点与原理 | 优点 | 缺点 |
|---|---|---|---|
| Angiotensin II (AngII) 灌注模型 | AngII灌注至Apoe−/−小鼠，诱导AAA形成 | - 模拟人类AAA病理特征（炎症、ECM降解等） - 适合动脉粥样硬化相关研究 - 造模时间较短 | - 仅Apoe−/−小鼠适用 - 可能导致胸主动脉病变 - 操作复杂，需注入泵 |
| 弹性蛋白酶（Elastase）灌注模型 | 弹性蛋白酶直接注入腹主动脉，导致弹性纤维降解 | - 操作简便，局部注射即可 - 与人类弹性纤维退行性变相似 - 控制AAA进展速度 | - 主要破坏弹性纤维，其他病理特征较少 - 适用于特定位置的AAA研究 |
| 钙盐（CaCl₂）涂敷模型 | 将钙盐涂在腹主动脉外，诱导局部炎症 | - 模拟炎症、ECM降解等多种病理特征 - 操作简单，避免复杂手术 | - 仅影响外层血管壁，可能不完全模拟全层病理 - 涂抹剂量和部位控制难 |
| 烟草素（PPE）模型 | 烟草素灌注腹主动脉，引发炎症和弹性蛋白降解 | - 模拟炎症和弹性蛋白降解等特征 - 容易控制剂量，灵活性高 | - 灌注时间控制严格，过量易破裂 - 主要在小鼠中应用，其他物种适用性有限 |
| 高脂饮食 + 遗传模型（Apoe−/− 或 Ldlr−/−） | 高脂饮食诱导Apoe−/−小鼠形成AAA | - 模拟代谢相关AAA - 可观察自然进展的AAA | - 形成时间较长，发生率低，受个体差异影响 - 仅适用于特定遗传背景 |
| 蛋白酶组合（弹性蛋白酶 + 胶原酶）模型 | 注入弹性蛋白酶和胶原酶，造成ECM降解 | - 模拟复杂的ECM降解过程 - 同时影响弹性蛋白和胶原蛋白，更接近人类AAA | - 控制复杂，易导致过度损伤 - 血管破裂风险较大 |
| 烟草暴露模型 | 长期烟草烟雾暴露，诱导血管炎症和退行性变化 | - 模拟吸烟风险因素的影响 - 适合慢性AAA病程研究 | - 形成时间长，AAA发生率低 - 烟雾环境控制难度高，成分复杂 |
| 基因修饰模型 | 基因敲除或过表达特定基因，观察AAA进展 | - 深入研究特定基因在AAA中的作用 - 模型稳定，重复性高 | - 建立周期长，成本高 - 受遗传背景影响大，不一定完全模拟人类AAA |
介绍：
在多种AAA的动物模型中，Apoe−/−小鼠接受血管紧张素II（AngII）注射的模型最为常用，该模型在炎症浸润、细胞外基质（ECM）降解、血管生成、氧化应激和血栓形成等方面表现出与人类AAA相似的病理特征。已有临床研究表明，约三分之一接受血管内修复的AAA患者存在贫血，且低循环血红蛋白浓度与AAA的大小独立相关，但该关联的机制尚不明确。一项对高脂血症小鼠的实验研究发现，抑制缺氧诱导因子1α（HIF）可以减缓AAA的进展，提示慢性贫血和HIF可能会触发促红细胞生成素（EPO）的产生。既往证据还表明，AngII可能通过直接刺激造血前体细胞受体或间接调节EPO的基因表达，影响造血。
EPO是一种主要调节红细胞生成的细胞因子，由胎儿肝脏和成人肾脏产生，其主要功能是通过激活红细胞生成素受体（EPOR）来促进红细胞生成。然而，EPO也通过表达在非造血组织的EPOR发挥超出造血功能的作用。例如，EPO可通过促进内皮细胞增殖、迁移以及基质金属蛋白酶2（MMP2）的生成，刺激新生血管形成。尽管有研究发现EPO通过抑制心肌细胞凋亡和增强一氧化氮（NO）的生成对心脏具有保护作用，但最新的荟萃分析显示EPO治疗对急性心肌梗死患者的心功能、梗死面积、心血管事件和全因死亡率没有明显益处。此外，高血清EPO浓度与心力衰竭的发病风险增加相关。EPO与AAA之间的关系尚不明确，因此此研究假设EPO可能通过促进血管生成和炎症反应来推动AAA的形成。
主要方法：
动物模型与EPO处理：• 采用Apoe−/−和野生型小鼠模型进行研究。通过注射不同剂量的EPO来检测其对AAA发生的剂量依赖性影响。AngII作为诱发AAA的对照处理，用以比较不同EPO剂量对AAA的影响。• 部分实验中，给Apoe−/−小鼠注射EPO单克隆抗体（EPO mAb）以阻断EPO的作用，并在另一组小鼠中敲低EPO受体（EPOR），进一步探讨EPO/EPOR在AAA中的具体作用。 组织和血清分析：• 使用组织学和免疫染色方法分析小鼠主动脉样本，以观察EPO对主动脉血管壁厚度、弹性层降解、微血管密度、平滑肌细胞（SMCs）和胶原蛋白的影响。• 使用实时定量PCR和Western Blot检测不同组别小鼠主动脉中的炎性细胞因子、血管生成因子及基质金属蛋白酶（MMPs）的表达水平。 体外实验：• 通过培养人脐静脉内皮细胞（HUVECs）、平滑肌细胞（SMCs）和巨噬细胞，研究EPO对细胞增殖、迁移、管状结构形成和MMP分泌的影响。• 通过黏附实验，检测EPO预处理的内皮细胞对单核细胞的吸引作用，并评估在EPO刺激下这些细胞分泌的炎性细胞因子。 人类血清样本检测：• 收集AAA患者和健康对照的血清样本，测定EPO浓度，并分析其与AAA直径的相关性。• 使用回归分析控制其他变量，进一步探讨EPO浓度与AAA之间的独立关联。
主要结果展示：
EPO剂量依赖性诱导AAA形成
Apoe−/−小鼠中使用EPO诱导腹主动脉瘤（AAA）
野生型小鼠中使用EPO诱导腹主动脉瘤（AAA）
• 在Apoe−/−小鼠中，EPO注射剂量越高，AAA的发生率越高。低剂量EPO组为26.7%，中剂量为40%，高剂量为66.7%。在野生型小鼠中，高剂量EPO使AAA发生率达到60%，而对照组仅为13.3%。
• 图示包含腹主动脉直径和生存率的变化，表明随着EPO剂量增加，Apoe−/−小鼠的腹主动脉扩张和死亡率也显著增加。
血管生成和促炎反应在EPO诱导的AAA中发挥重要作用
• 通过Masson染色和免疫组织化学染色显示，腹主动脉中α-SMA、endomucin、MMP2、MMP9和MT1-MMP的阳性染色信号显著增加。这些变化表明EPO促进了血管生成和基质降解的过程。
• Col I和Col III的表达在EPO处理的小鼠腹主动脉中显著降低，而MMP2、MMP9和MT1-MMP的表达和活性增加，这些蛋白的活性变化进一步说明EPO诱导的ECM降解可能是AAA形成的一个重要机制。
• EPO处理的腹主动脉组织中，促炎细胞因子（如IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α）的蛋白和mRNA表达显著上调，并且与巨噬细胞的共定位增强。这些结果表明EPO可能通过诱导局部和全身性的炎症反应加速AAA的发展。
• 血清中IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α浓度在EPO处理组显著高于对照组，表明全身炎症反应参与了EPO诱导的AAA形成。
EPO在AngII诱导的AAA中作用显著
• 在Apoe−/−小鼠中，AngII显著提高了AAA的发生率，且联合EPO中和抗体（EPO mAb）处理后，AAA的发生率显著降低。这表明EPO和其受体EPOR在AAA形成中发挥了重要作用。
• 与单纯Apoe−/−小鼠相比，Epor+/−Apoe−/−小鼠在接受AngII处理后，AAA的发生率和腹主动脉直径均显著降低。且在Epor+/−Apoe−/−小鼠中，AAA相关的炎症因子和血管生成因子的表达显著减少，进一步支持了EPOR在AAA形成中的作用。
• 免疫组化显示Apoe−/−和Epor+/−Apoe−/−小鼠在AngII处理后，MMP2、MMP9、MT1-MMP、IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α等蛋白表达的显著差异。这些结果表明，EPOR信号通路在炎症反应和基质降解过程中起到了关键作用。
ECs是EPO诱导血管生成所必须的
•EPOR mRNA表达量在ECs中最高。EPO处理可以显著增加ECs的增殖，迁移和管腔形成能力。
•EPO处理会增加ECs中ECM降解相关蛋白的表达（MMPs）。
ECs介导了EPO诱导的炎症、胶原降解和平滑肌细胞（SMC）凋亡
• 在体外实验中，EPO处理的HUVEC（人脐静脉内皮细胞）增加了单核细胞THP-1的黏附。HUVEC预处理的培养基也诱导巨噬细胞中促炎细胞因子的mRNA表达（如IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α），显示出EPO通过内皮细胞介导的炎症反应。
• 在平滑肌细胞（SMC）中，EPO预处理的HUVEC培养基显著降低了胶原蛋白I和III的表达，同时增加了MMP2和MMP9的表达及活性，表明EPO通过内皮细胞促进了胶原蛋白的降解。使用TUNEL染色和BAX/BCL2比率评估发现，EPO预处理的HUVEC培养基显著增加了SMC凋亡。EDU染色显示，EPO预处理的HUVEC培养基显著抑制了SMC的增殖，进一步表明EPO通过内皮细胞间接影响了SMC的增殖和存活。
EPO促进体内血管生成和吞噬细胞浸润
• 经过EPO处理的小鼠中的Matrigel插入物，显示比对照组更高的血管生成活性；更多的吞噬细胞以及明显增加的血管数量。双重免疫染色结果显示，EPO处理的Matrigel插入物中Ki67+增殖内皮细胞（ECs）的数量显著高于对照组，表明EPO显著促进了ECs的增殖和迁移。
• 与对照组相比，EPO处理的小鼠中的Matrigel插入物中的CD68、IL-6、IL-1β、MCP-1和TNF-α的蛋白表达显著增加，说明EPO增强了巨噬细胞的入侵并促进了炎性因子的分泌
• Western blot结果显示，EPO处理的HUVECs中JAK2和STAT5的磷酸化水平显著升高。使用JAK2抑制剂（TG101348）和STAT5抑制剂后，磷酸化水平显著降低，这表明EPO通过激活JAK2/STAT5信号通路诱导血管生成 。管腔形成实验中，在添加JAK2或STAT5抑制剂后，EPO对HUVECs促血管生成的作用明显被抑制，进一步证实了JAK2/STAT5通路在EPO诱导血管生成中的关键作用。
文章的新颖之处
揭示EPO在AAA形成中的双重作用：
• 本研究发现EPO不仅通过刺激血管生成促进AAA的发展，还通过诱导强烈的炎症反应，揭示了EPO在AAA形成中具有双重作用的机制。这一发现为理解EPO在血管病变中的作用提供了新视角。
首次明确EPO/EPOR信号在AAA中的作用机制：
• 该研究首次提出EPO通过激活EPOR同源二聚体受体，而非异源二聚体，参与AAA的发生发展。通过选择性抑制EPOR同源二聚体受体，有望提供一种特异性更强的治疗策略。
通过JAK2/STAT5通路研究血管生成的具体机制：
• 文章深入探讨了EPO通过JAK2/STAT5信号通路在内皮细胞中诱导血管生成的机制，为研究EPO在血管生成中的作用机制提供了新的证据，也为治疗血管病变指明了潜在的靶点。
多层次的实验设计验证EPO的作用：
• 本研究在动物模型、体外细胞实验和组织学分析中多层次地验证了EPO在AAA形成中的作用，确保了结果的可靠性和一致性。同时通过使用EPO中和抗体和基因敲除技术，使结果更具说服力。
探讨了EPO对ECM降解的调控作用：
• 研究表明EPO可通过内皮细胞诱导基质金属蛋白酶（MMP2和MMP9）的表达，促进细胞外基质（ECM）的降解。这是EPO在血管病变中的另一重要机制，有助于理解其在ECM降解中的调控作用。
提供了潜在的临床应用启示：
• 研究结果表明，通过抑制EPO或EPOR信号，有可能有效地抑制AAA的形成与进展。这一发现为AAA的临床治疗提供了新的靶点和方向，可能为未来药物开发提供理论依据。
这些亮点和创新点为AAA的病理机制提供了新的理解，也为未来相关疾病的研究与治疗带来了重要的启示。
关于此研究的一些思考
1、相比于其他方法，EPO治疗在野生型和Apoe−/−小鼠中都展现出相当高的主动脉瘤形成率并且造模方式及其简单，这意味着不用昂贵的Apoe−/−小鼠也可以进行批量主动脉瘤造模，对于研究经费不足以及技术尚不成熟的课题组十分有利。但值得注意的是，EPO造模方法与AngII造模方法一样，也是在肾上腹主动脉形成动脉瘤，这与临床上肾下主动脉形成动脉瘤为主不太一致。
2、EPO治疗能在主动脉这种大血管中引起血管生成和炎症反应从而形成动脉瘤，那对于小血管是否也会有相同的作用呢？换句话说，在大血管中能高效的形成动脉瘤，对于小血管这种情况是不是会加剧导致血管破裂？或者，主动脉中有更多的EPO受体？亦或是主动脉或者肾上动脉对EPO的刺激更具特异性？如果能对这些方面进行更深入的研究或许能发现有趣的东西。
当然以上只是个人的看法和思考，大家有建议或者想法可以一起讨论呀～
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