A族肠道病毒(EV-A)包含25种血清型，可引起多种疾病，包括手足口病、咽峡炎、心肌炎、脑炎、无菌性脑膜炎和急性弛缓性麻痹，甚至死亡。据报道，EV-A成员柯萨奇病毒CVA2、CVA3、CVA4、CVA5、CVA6、CVA10和CVA12使用KREMEN1 (KRM1)蛋白作为细胞受体。然而，KRM1受体广谱识别这七种肠道病毒的分子基础仍然不清楚。
近期，上海市重大传染病和生物安全研究院张超课题组在微生物学国际高水平期刊mBio在线发表了题为“Completely conserved VP2 residue K140 of KREMEN1-dependent enteroviruses is critical for virus-receptor interactions and viral infection”的研究性论文。该研究报道了VP2残基K140在所有依赖KRM1受体的肠道病毒中均完全保守，并在病毒受体结合和病毒感染中发挥至关重要的作用。
张超课题组在2023年的研究揭示过VP2残基N142（命名为N2142）对于CVA10结合KRM1受体和感染非常重要（PLOS Pathogens, 2023）。N2142在CVA2、CVA4和CVA6病毒中高度保守，而在CVA3、CVA5和CVA12中则为其他氨基酸（T、S或Q）（图 1A）。因此，仅凭N2142残基不足以解释为什么这么多种肠道病毒可以共用一种受体蛋白KRM1。之前发现的不足，促使其课题组进一步研究其他可能的分子机制。
在本研究中，研究者首先通过结构分析，发现VP2蛋白的EF loop，特别该loop的N2138到E2143位残基，是CVA10病毒与KRM1受体密切接触的关键区域之一（图1B-C）。利用CVA10的感染性克隆，对该区域的残基进行丙氨酸突变扫描，在293T细胞中拯救病毒，然后在RD细胞中扩增一代，并测定滴度。野生型（WT）CVA10以及突变体N2138A、T2139A、P2141A和E2143A均成功拯救，并得到测序证实，这些突变病毒仍对可溶性受体蛋白hKRM1-Fc的中和高度敏感（图1D），提示这些位点对于CVA10感染和受体结合而言可能不重要。然而，对于K2140A突变体，在RD细胞中未检测到明显的细胞病变和病毒滴度（图1D）。这些结果表明VP2残基K140 （K2140）可能是CVA10感染的关键残基。
K2140A突变似乎对CVA10有害。由于残基K2140位于病毒表面，高度暴露，该位置的突变可能会影响病毒的吸附和进入，而不是病毒的复制、组装和释放。因此，提出了一个假设：K2140A突变体已在转染的293T细胞中得到拯救，但293T拯救出的突变病毒可能无法有效结合和感染RD细胞，导致RD没有出现病变和病毒滴度。为了验证该假设，对感染性克隆质粒转染的HEK 293T细胞的上清液直接进行检测，去掉RD细胞扩增步骤。从转染的293T细胞培养上清（1L体积）中成功纯化出了CVA10-WT和CVA10-K2140A突变体的成熟病毒颗粒，并得到负染电镜的证实（图1E-F）。
细胞吸附实验证明K2140A突变会显著降低CVA10病毒对RD细胞表面的结合能力（图1G）。与之一致的是，受体结合ELISA实验证明K2140A突变可使CVA10与KRM1受体蛋白的结合活性丧失（图1H）。乳鼠感染实验证明K2140A突变可以显著降低CVA10对小鼠的致病力 (图1I)。综上，这些结果表明残基K2140不仅在CVA10的受体识别、细胞吸附和病毒感染中起着至关重要的作用，而且在CVA10对小鼠的毒力中也发挥关键作用。
为了进一步测试2140位的K残基是否是CVA10感染所必需的，利用CVA10感染性克隆质粒对2140位进行饱和式突变分析，用各种其他氨基酸取代K2140。转染293T细胞拯救，然后在RD细胞中扩增，测定滴度并测序。如图1J-K所示，只有CVA10-K2140R突变病毒成功拯救，并且遗传稳定，但K2140R病毒的滴度和受体结合活性明显低于野生型病毒。而其余突变体要么没有病毒滴度，要么产生回复突变。因此饱和式突变分析证明了2140位Lys残基在CVA10感染中的重要性。
图2. 残基K2140在所有依赖KRM1的肠道病毒中均完全保守，并在其感染中发挥关键作用。之前未报到受体利用的CVA8病毒也通过K2140残基利用KRM1蛋白作为细胞受体。
