近日，重庆大学医学院罗阳教授联合山东大学第二医院王传新教授、张洪博士后在《Small Methods》发表题为“Commercial Strip-inspired One-pot CRISPR-based Chip for Multiplexed Detection of Respiratory Viruses”的文章，并获选为2025年首期封面文章。该文章以商业妊娠试纸作为结果输出载体，构建了RECOGNIZER（Re-building commercial pregnancy strips via large-size nanoflowers）检测体系，可在25分钟内同时检测4种呼吸道病毒。该体系利用具有大比表面积的DNA纳米花（DNFs）用于人体绒膜促性腺激素（hCG）报告探针的高效装载，信噪比达到10倍以上。经等温扩增预处理后，该方法检出限低至10 拷贝/微升，且50例临床咽拭子样本验证准确率达100%。RECOGNIZER体系具有高度的可编程性，有望成为用户友好的病毒感染监测平台，为病毒大流行的应急救援提供技术支持。
RECOGNIZER标准检测流程包括样本裂解、一步法信号扩增和微流控芯片读取，仅需25分钟即可实现四种不同呼吸道病毒的同步检测。
利用滚环扩增技术合成的DNFs呈现花状结构，平均粒径约为1 μm，储存200天后仍然保持稳定。
图2 DNFs的合成与表征
利用化学耦连将hCG蛋白标记在核酸探针上，并与DNFs杂交成功制备hCG-DNFs。相较于其他捕获技术（如hCG-RCA，hCG-beads等），hCG-DNFs显著提升hCG捕获效率，且具有更高的CRISPR切割效率，信噪比超10倍。进一步构建四通道微流控芯片，可最低检测到0.1 nM的新冠核酸样本。
图3 hCG-DNFs的制备与性能验证
进一步对影响链置换和CRISPR切割反应的关键因素（如DNFs杂交比例、序列设计、缓冲液浓度、反应时间等），以达到最佳检测灵敏度。
图4 RECOGNIZER条件优化
在优化的反应条件下，系统地验证了RECOGNIZER的检测性能。RECOGNIZER对核酸片段的最低检出限达5.42 皮摩尔。利用等温扩增对病毒颗粒进行预扩增，RECOGNIZER可最低检测到10拷贝/微升的病毒颗粒，满足大规模筛查需求。与此同时，RECOGNIZER具有较高的特异性、可重复性和稳定性。50例临床样本检测结果准确率达100%。
图5 RECOGNIZER检测性能验证
为拓展RECOGNIZER检测场景，研制高通量呼吸道病毒检测芯片及读取应用软件，仅需简单的加样、扫描步骤，即可实现4种不同呼吸道病毒（新型冠状病毒、中东呼吸系统综合征冠状病毒、甲型流感病毒、乙型流感病毒）的同步检测，最低检出限分别达到5.42 皮摩尔、5.85皮摩尔、4.38 皮摩尔和6.34皮摩尔。
图6 高通量呼吸道病毒联合检测芯片验证
综上所述，本研究以商业妊娠试纸为读取载体，构建了快速、可编程、超敏的高通量呼吸道病毒检测平台，极大地简化了商业试纸条开发流程。
来源 重大检验
编辑 老Q
