作者：郭文轩，周子昱，马可馨，杨悦瑶，李逸帆，李雅娟，周贺*
单位：大连海洋大学水产与生命学院
简介：郭文轩，女，辽宁葫芦岛人，硕士研究生，研究方向：水产遗传育种与繁殖。*通信作者，副教授，博士，硕士生导师，从事水产动物繁殖育种研究。
基金项目：国家自然科学基金项目（31272650）。
来源：《安徽农业科学》2024年18期
引文格式：郭文轩,周子昱,马可馨,等.杂交3倍体泥鳅鳍细胞系染色体组构成研究[J].安徽农业科学,2024,52(18):67-70,77.
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泥鳅（Misgurnus anguillicaudatus）隶属于鲤形目（Cypriniformes）鳅科（Cobitidae）泥鳅属（Misgurnus），是我国水产养殖行业的潜力产品。据报道，泥鳅存在自然多倍化现象，在我国的天然水域中已发现5种不同倍性的泥鳅种类，包括2倍体（2n=50）、3倍体（3n=75）、4倍体（4n=100）、5倍体（5n=125）和6倍体（6n=150）。多倍体泥鳅普遍具有个体大、生长快及适应性强等优良的经济性状，具有很大的育种潜力。通过化学或物理等诱导方法培育3倍体存在价格较贵，成功率较低等问题，而4倍体与2倍体泥鳅杂交的方式可以稳定高效地获得3倍体。
鱼类细胞培养作为重要的试验技术，为遗传学、病毒学和生理学等研究提供了试验基础。据报道，该技术始于20世纪60年代，随后众多鱼类组织细胞系相继成功建立。其组织种类多样，如肾脏、鳍、鳔、性腺和肝脏等。鳍细胞相较于其他类型体细胞的优势在于鳍是可再生器官，既能保护试验材料，又可以重复利用，更有利于物种细胞遗传学的相关研究。近年来，有研究已将传代培养的鳍细胞作为材料成功应用在2倍体和4倍体泥鳅的染色体研究中。
探究正反交3倍体泥鳅鳍细胞经细胞培养传代后的染色体组构成，旨在为泥鳅的细胞遗传学研究提供数据支撑。
通过天然4倍体（4n=100）和2倍体（2n=50）泥鳅杂交创制不同子代杂交组合（4n♀×2n♂、2n♀×4n♂），样本规格见表1。以传代20次的杂交3倍体泥鳅鳍细胞系为材料，采用常规冷滴片法制备染色体标本，通过吉姆萨染色确定数目及核型；通过银染法及CMA3/DA/DAPI三重荧光染色技术对其进行带型分析。
◆染色体数目及核型分析
从4倍体与2倍体泥鳅正反交后代4n♀×2n,2n♀×4n♂传代20次的鳍细胞中期分裂相中选取形态清晰且分散良好的50个中期分裂相进行统计分析。结果显示：正反交每尾个体的10个分裂相众数均为75条，个体间不存在差异；4n♀×2n♂后代的染色体数目为70~79条，众数为75条，占比70%；2n♀×4n♂后代的染色体数目为72~79条，众数为75条，占比66%（表2）。
正反交后代鳍组织培养20代的细胞染色体数目均为3n=75（图1a、图1c），核型公式为3n=15m+6sm+54t，NF=96（图1b、图1d）。
注：a、b.4n♀×2n♂；c、d.2n♀×4n。
图1 杂交3倍体泥鳅鳍细胞中期分裂相及吉姆萨染色核型
◆Ag-NORs分析
4倍体与2倍体泥鳅正反交后代（4n♀×2n♂,2n♀×4n♂）传代20次的鳍细胞中期分裂相均显示3个Ag-NORs（图2a、图2c）；根据核型分析可知，正反交后代染色体的NORs均位于第1组中部着丝粒染色体（M1）短臂的末端位置（图2b、图2d）。
注：箭头示银染点。a、b.4n♀×2n♂♂；c、d.2n♀×4n♂。
图2 杂交3倍体泥鳅鳍细胞染色体中期分裂相及银染核型
◆CMA3/DA/DAPI分析
4倍体与3倍体泥鳅正反交后代（4n♀×2n♂,2n♀×4n♂）传代20次的鳍细胞染色体标本经CMA3/DA/DAPI三重荧光染色处理后，选择分散良好的中期分裂相镜下观察。结果显示：用蓝光（λ=360~400nm）激发，在正反交后代的中期分裂相中可观察到3条DA/DAPI荧光带（图3a、图3d）；用蓝光（λ=440~480nm）激发，正反交后代的中期分裂相中均表现出3个CMA3阳性部位（图3b、图3e）；由核型分析可知，CMA3阳性位点位于第1组中部着丝粒染色体（M1）短臂的末端部位（见图3c、图3f）。
注：箭头示荧光信号；a、b.4n♀×2n♂♂；c、d.2n♀×4n♂。
图3 杂交3倍体泥鳅鳍细胞染色体中期分裂相及CMA3/DA/DAPI三重荧光染色核型
正反交3倍体鳍细胞系的染色体分裂相数目为3n=75，核型公式15m+6sm+54t，NF=96；正反交3倍体泥鳅鳍细胞系的染色体分裂相中显示有3个银染点，均位于第1组中部着丝粒染色体（M1）短臂的端部区域；正反交3倍体泥鳅鳍细胞的染色体中期分裂相中显示有3个CMA3荧光信号点，均位于M1区域。杂交3倍体泥鳅鳍细胞经细胞培养传代20次后的染色体组成未发生改变，其染色体数目、核型和带型与3倍体泥鳅其他体细胞结果一致。
采编：小白
排版：小同
