作者：李平，胡建燃*，郭春燕，武玉珍
单位：晋中学院生物科学与技术系
简介：李平，女，山西大同人，副教授，博士，从事微生物学及天然产物活性研究。*通信作者，副教授，博士，从事天然产物活性研究。
基金项目：山西省基础研究计划（自由探索类）青年项目（202203021222292）；山西省基础研究计划（自由探索类）面上项目（20210302123493）；山西省教育厅高等学校科技创新项目（2022L501，2021L487）；晋中学院“百亿工程”天然产物开发利用创新团队培育项目。
来源：《安徽农业科学》2024年19期
引文格式：李平,胡建燃,郭春燕,等.一株南方红豆杉内生菌HDSW的抗肿瘤活性研究[J].安徽农业科学,2024,52(19):145-150.
OSID开放科学计划
长按识别论文专属二维码，听作者讲述论文写作背景，与同行交流心得体会。
南方红豆杉（Taxus chinensis var.mairei Cheng et L.K.Fu）是常绿乔木，为我国一级濒危保护植物，主要分布于我国陕西、河南、江西、广西、福建等省（区）。研究发现，红豆杉属植物含有多种药理活性成分，如紫杉醇、槲皮素、红豆杉多糖、紫杉碱、胡萝卜甾醇等。其中，紫杉醇是经典的高效抗癌化合物，在20世纪90年代初已被美国食品药品监督管理局正式批准为新抗癌药物，但是，由于其在红豆杉属植株中的含量极低，无法满足市场需求。因此，寻找如紫杉醇等具有重要药理活性的天然化合物资源，已成为当前抗肿瘤新药研发领域的重要科学任务。
植物内生菌是一类在其生活史的某个或全部时期定殖于植物的组织和器官内的微生物，宿主植物无明显的感染症状，细菌、真菌和放线菌是其主要类群。在长期进化过程中，由于植物细胞内次级代谢产物合成相关的基因发生水平转移等因素，部分内生菌具备了产生与宿主植物相同或相似的化合物的能力。
基于已有研究，南方红豆杉内生真菌和内生放线菌是抗肿瘤天然产物的潜在资源库，但是，目前鲜见在内生细菌中发现具有抗肿瘤活性的菌株。
鉴定南方红豆杉抗肿瘤内生菌HDSW，并初步研究其抗肿瘤机制。
基于16S rDNA测序鉴定菌株HDSW的种属，通过MTT试验、平板细胞集落形成试验、细胞黏附试验、划痕试验和流式细胞术检测HDSW发酵液的有机溶剂提取物对胃癌细胞MGC-803的抑制活性，利用实时定量PCR方法探索其抗肿瘤的分子机制。引物序列见表1。
◆菌株HDSW形态特征
将菌株HDSW接种于LB固体平板，在28℃恒温培养，如图1所示，菌落颜色为不透明的乳白色，形状不规则，表面不光滑、有褶皱。
图1 菌株HDSW的平板培养（A）和菌落形态（B）
◆菌株HDSW的分子生物学鉴定
将16S rDNA测序序列在NCBI网站进行比对，利用Mega 7软件构建系统发育树（图2），聚类结果表明菌株HDSW属于芽孢杆菌属（Bacillus pumilus）。
图2 基于16S rDNA的系统发育树聚类分析
◆菌株HDSW发酵上清液对胃癌细胞MGC-803的抑制活性
将菌株HDSW接种于LB液体培养基，在28℃、150r/min振荡培养5d后，离心并收集上清液，过滤除菌后，按照体积比10%加入细胞培养基中，进行MTT试验，结果如图3所示。在初始细胞数量相同的情况下，经HDSW菌株发酵液处理24h后，细胞数量（OD570值）明显低于对照细胞（P<0.01），随着处理时间的延长，在48、72、96和120h处检测的OD570值均存在显著差异（P<0.01），表明HDSW菌株发酵液能够明显抑制胃癌细胞MGC-803的生长。
注：与对照相比，**P<0.01。
图3 菌株HDSW发酵上清液对胃癌细胞MGC-803增殖的抑制活性
◆菌株HDSW发酵液有机溶剂提取物对MGC-803细胞的抑制活性
对MGC-803细胞生长的影响。分别利用石油醚和乙酸乙酯提取菌株HDSW的发酵液，通过减压蒸馏及干燥后获得固体提取物，经DMSO溶解后，检测终浓度10mg/mL的提取物对胃癌细胞MGC-803的抑制作用，结果如图4所示。由图4可见，随培养时间的延长，与对照相比，石油醚提取物不能抑制细胞的增殖，而乙酸乙酯提取物则在细胞培养24h时即显示出显著的抑制活性（P<0.05），在48和72h时差异极显著（P<0.01）。
注：与对照相比，*P<0.05，**P<0.01。
图4 不同有机溶剂提取物对MGC-803细胞增殖的抑制活性
对MGC-803细胞集落形成的影响。通过平板集落形成试验，分别检测了菌株HDSW发酵液的石油醚和乙酸乙酯提取物对MGC-803细胞生长的影响，结果如图5所示。由图5可见，与对照细胞相比，石油醚提取物不能明显抑制细胞集落的形成，乙酸乙酯提取物处理组则未见细胞集落，表明菌株HDSW发酵液中抑制MGC-803细胞生长的活性物质可被乙酸乙酯提取，却不能被石油醚提取。
图5 不同有机溶剂提取物对MGC-803细胞集落形成的影响
对细胞黏附的影响。以终浓度均为10mg/mL的石油醚和乙酸乙酯提取物处理MGC-803细胞72h，黏附试验结果（图6）显示，石油醚提取物不影响细胞的黏附，乙酸乙酯提取物则显著减少了黏附细胞的数量（P<0.01），表明在乙酸乙酯提取物中存在抑制MGC-803细胞黏附能力的化合物。
注：与对照相比，**P<0.01。
图6 不同有机溶剂提取物对MGC-803细胞黏附能力的抑制作用
对细胞迁移的影响。通过细胞划痕试验，检测菌株HDSW发酵液的石油醚和乙酸乙酯提取物对胃癌细胞MGC-803迁移的影响，结果如图7所示。
注：A.划痕试验；B.细胞迁移率。与对照相比，** P<0.01；与石油醚提取物处理组相比，##P<0.01。
图7 不同有机溶剂提取物对MGC-803细胞迁移的影响
从图7可以看出，在细胞划痕12h后，与对照组相比较，石油醚提取物能够显著抑制细胞的迁移（P<0.01），而乙酸乙酯提取物的抑制能力强于石油醚提取物（P<0.01），表明菌株HDSW发酵液中存在能够抑制胃癌细胞MGC-803迁移运动能力的有效成分，石油醚和乙酸乙酯均能够提取出上述活性物质，而且乙酸乙酯的提取效果明显强于石油醚。
对细胞凋亡的影响。通过annexin V-FITC/PI双染法，利用流式细胞仪检测菌株HDSW发酵液不同提取物处理的MGC-803细胞，分析菌株HDSW发酵产物对细胞凋亡的影响，结果如图8所示。对照组、石油醚组和乙酸乙酯组的凋亡率分别为6.12%、6.48%、22.21%。与对照组相比，石油醚提取物不能导致MGC-803细胞凋亡（P>0.05），而乙酸乙酯提取物则可显著提高该细胞的凋亡率（P<0.01）。上述结果表明，菌株HDSW产生了能够诱导胃癌细胞MGC-803凋亡的次级代谢产物，且可被乙酸乙酯提取，但不能被石油醚提取。
图8 菌株HDSW发酵液的有机溶剂提取物对MGC-803细胞凋亡的影响
对凋亡相关基因表达的影响。通过实时定量PCR检测细胞凋亡相关基因的表达情况，探讨菌株HDSW代谢产物抑制胃癌细胞MGC-803的分子机制，结果如图9所示。由图9可见，与对照相比，乙酸乙酯提取物能够显著提高抑癌基因p53（P<0.01）、凋亡促进基因Bax（P<0.01）和凋亡相关基因Caspase 3（P<0.01）的表达水平，却显著降低凋亡拮抗基因Bcl-2（P<0.01）的表达。因此，菌株HDSW发酵液中存在的细胞凋亡诱导化合物能够影响凋亡相关基因的表达。
注：与对照相比，** P<0.01。
图9 菌株HDSW发酵液不同有机试剂提取物对凋亡相关基因表达的影响
南方红豆杉内生菌HDSW可产生具有显著抗胃癌细胞MGC-803活性的次级代谢产物，且乙酸乙酯可将其提取出来，具有潜在的开发价值。
采编：小白
排版：小同
