基因测序已经是当下热门,纵观基因测序的发展史,从Sanger测序法到PCR扩增测序再到PacBio SMRT和Oxford Nanopore技术,逐渐实现单分子测序,超长读长等要求。而纳米孔测序技术是最近几年兴起的新一代测序技术。目前测序可以达到250Gb。这项技术开始于90年代,经历了三个主要的技术革新:单分子DNA从纳米孔通过,纳米孔上的酶对于测序分子在单核苷酸精度的控制,单核苷酸的测序精度控制。
目前用于DNA测序的纳米孔可以大致分为两类,生物孔和固体孔。由于 DNA 链的直径非常小(双链 DNA 直径约为 2 nm, 单链 DNA 直径约为1 nm), 所以对所采用的纳米孔的尺寸有着近乎苛刻的要求。
常见的生物孔是基于成孔毒素(PET)获得。成孔毒素是一种基于蛋白质的毒素,通常由病原体产生。它们可以在靶细胞膜上形成致命的纳米级孔隙。多种离子和生物分子(包括葡萄糖和氨基酸)可以逸出,让周围环境中的水进入孔道。致病性 PFT 通常会产生小孔(0.5-5 nm)或大孔(20-100 nm)。
用于DNA测序的生物孔多采用的是α-溶血素(α-HL), 其最窄处直径尺寸约为 1.4 nm,恰好允许单链 DNA 分子通过。完整用于测序的生物孔由两种蛋白组成,一个蛋白用于对DNA进行解旋,另一个蛋白插入脂质双层膜,并进行单通道电生理测量。
因此,Nanopore测序的流程可简述为:
1. 解旋,将双链DNA解开成单链。
2. 在一定偏压下,DNA单链分子通过孔道蛋白。
3. DNA停留在孔道中,有一些离子通过带来电流变化,而不同的碱基带来的电流变化是不同的。
图2 纳米孔测序原理示意图[2]
这种检测技术的优势在于单分子分辨率,无需PCR扩增,理论上可以读取无限长的DNA,对全因组测序提供了极高的应用价值。
而另一类固体孔主要是利用硅及其衍生物制造而成, 一般使用离子束或电子束在硅或其他材料薄膜表面钻出纳米尺度的孔洞, 再进一步对孔的形状和大小进行修饰而成。相比于生物纳米孔, 固态纳米孔在稳定性、电流噪声、工艺集成方面有着显著的优势, 但是因为受限于如今的半导体工艺制造水平, 固态纳米孔的制造还较为复杂与昂贵,以及没有特定蛋白对DNA过孔识别存在极大的难度,因此也一直没有被应用于商业化生产。
图4 MinION示意图[5]
本文仅供参考、交流之目的,不代表本公众号和本刊立场。
关 于 我 们
进 入 学 术 交 流 群
《电化学》为各位提供交流学习的平台,欢迎按照研究方向进群交流,编辑部将不定期分享最新研究进展、会议、招聘等各种信息。欢迎扫码添加小助手,进入各研究方向交流群:
1、电催化 燃料电池
4、电化学研究方法