Differential Leaf-to-Root Movement, Trophic Transfer, and Tissue-Specific Biodistribution of Metal-Based and Polymer-Based Nanoparticles When Present Singly and in Mixture
金属基和聚合物基纳米颗粒单一和混合暴露不同的叶-根迁移、营养转移和组织特异性生物分布
通讯单位： 上海交通大学环境科学与工程学院
通过叶面吸收和陆地食物链转移纳米颗粒（NP）的风险知之甚少，特别是在涉及共污染和植物易位的情况下。在此，我们将萝卜暴露于单一和混合叶面剂量的CeO2 NP和氘代聚苯乙烯（DPS）中，研究NP从萝卜茎/根到蜗牛的营养转移。与单一暴露相比，混合暴露增加了植物对Ce的吸收，但对DPS的吸收没有影响。此外，混合暴露不影响Ce和DPS从茎到根的运动。在NP混合暴露下，以芽为食的蜗牛对Ce和DPS的营养转移效率（TTF）显著降低。在根饲蜗牛中，Ce的TTF也显著降低，而DPS的TTF保持不变。混合暴露对不同的蜗牛身体部位表现出不同的影响，特别是导致接触混合物的食用根部的蜗牛消化腺和软组织中DPS的生物放大（TTF>1）。CeO2和DPS在转移到根部后，同化效率突然增加。这项研究深入探讨了与纳米颗粒相关的共暴露和植物易位过程导致营养转移过程中的变化，增强了我们对其环境风险的理解。
Synopsis
This study provides quantitative evidence that concurrent exposure and translocation of nanoparticles from shoots to roots significantly impact uptake by plants, trophic transfer efficiency, and the animal assimilation rate of CeO2 and deuterated polystyrene nanoparticles across the cherry radish (shoots/roots)─snail food chains.
纳米颗粒（NP）是指至少有一个维度测量值低于100nm的材料。金属基工程纳米材料（ENM）和聚合物基纳米塑料是这一类别中两种众所周知的功能材料。 工程纳米材料是专为特定应用而设计的有意制造的材料，通常成分均匀，而纳米塑料主要来自环境中塑料废物的分解。新型工业材料的发展使其在社会相关产品和环境中广泛存在。随着时间的推移，塑料产量急剧增加，从1950年的150万吨增加到2021年的3.9亿吨。 全球ENMs的年产量估计在几千吨到不超过一百万吨之间。 然而，我们对纳米材料相关环境风险的理解落后于我们设计和应用这些材料的能力。这导致了全球范围内对“纳米污染”的担忧。在土壤和水环境中进行了许多研究，揭示了NP暴露对生物体的潜在不利影响及其随后通过食物链的转移。虽然已知纳米颗粒物可以作为细颗粒物在大气中长期存在，但缺乏对其区域和全球暴露途径的研究。植物在地球表面起着天然的“绿色屏障”作用，它们的叶子是大气中NP沉积和积累的主要场所。在沉积到叶片表面后，NP主要通过气孔、水合作用和角质层渗透性被叶片吸收。NP的摄取受尺寸、表面积、化学成分和亲水性/疏水性等关键因素的影响。由于生理和解剖差异，NP吸收的尺寸排除极限因植物物种而异，但通常低于100 nm。在现实世界中，NP可能会在生物或非生物压力下发生聚集、溶解、转化和沉积，这会显著影响它们的特性。与对NP通过根系转移的广泛研究不同，有限的研究侧重于探索和检查这些颗粒如何被植物叶片从大气中吸收，随后通过食物链转移到更高的营养水平。鉴于食物源植物作为初级生产者的关键生态作用及其作为污染物进入食草动物和人体的重要途径的作用，必须对食物链中叶片表面暴露于NP的情况进行进一步研究。
先前的研究表明，各种类型的NP可以被植物吸收并沿着食物链转移，包括TiO2、Ag2O、CeO2、Fe3O4和ZnO NP。例如，在烟草-烟草角虫食物链中，植物通过水培吸收了NP，其生物累然而，研究也表明，植物吸收和内化了CeO2 NP，但在莴苣-斜纹夜蛾和小白菜蜗牛食物链中没有明显的积累和生物放大。这些研究主要侧重于描述由于不同NP流在营养水平上的高度可变性，单个材料内的形态和尺寸变化引起的转移效率差异。然而，当考虑到混合物中存在的代表性ENM和纳米塑料等纳米材料的共存时，由于多种原因，它们在食物链中的运输在很大程度上仍然未知。首先，金属基和聚合物基纳米颗粒的化学成分和密度存在显著差异，这使得仅从单一暴露中推断数据变得具有挑战性。此外，NP的共存可能会导致相互作用，从而形成复杂的污染物，从而改变NP的环境行为，进而影响植物积累和食物链转移。此外，由于在典型的生物群富碳环境中检测生物体内碳基材料的局限性，纳米塑料在食物链中转移的机制仍然未知。
此外，纳米颗粒在内化后可以重新定位到其他植物器官，几项研究记录了某些NP在水稻和黄瓜等植物不同部位的生物转化。可以合理地假设，暴露在叶子中的NP可能会向根部迁移，从而影响NP沿食物链的转移效率及其生物利用度。据我们所知，尚未进行任何调查来比较储存在各种植物器官（特别是可食用部分）中的NP在沿食物链的营养转移及其对消费者的后续影响方面的性能。考虑到食用不同植物成分的动物的随机摄食行为，这种比较至关重要。樱桃萝卜是一种重要的十字花科粮食作物，其可食用部分从地上的绿叶到膨胀的地下主根。CeO2是全球生产量最大的ENM之一，广泛应用于抛光剂、催化剂、防腐剂和传感器等工业应用。具体来说，在农业中，它充当生长调节剂、杀虫剂、肥料、营养素或药物载体。此外，实地研究表明，植物表面存在聚苯乙烯（PS）微塑料和纳米塑料。此外，CeO2 NP被用作添加剂，以提高PS产品的机械强度和热稳定性。根据实际情况，选择的代表性NP是CeO2和PS，能够通过有意的人工施用或非自发的大气沉积到达植物，导致叶面共同暴露。
在这项研究中，我们建立了一个涉及樱桃萝卜（茎/根）和蜗牛的食物链。我们首次合成了氘化聚苯乙烯（DPS），以应对在富含碳的生物体内检测碳基材料的挑战。我们的假设有两个方面：1）与暴露于单一颗粒相比，叶子暴露于NP混合物会影响植物对CeO2/DPS的吸收和转运，2）储存在叶子和根中的纳米粒子在营养转移效率、消费者积累以及在单一和混合暴露模式下的分布方面表现不同。这项研究的结果将加深我们对DPS-CeO2混合物如何通过食物链途径在生物体内表现的理解。
Characterization of Nanoparticles 纳米颗粒的表征
TEM图像显示，CeO2纳米颗粒表现出聚集的趋势，形成平均直径为47.8±10.8 nm的不规则团聚体（n=50）。相比之下，DPS表现出优异的分散性，为平均直径为80.7±0.8 nm的规则球形颗粒（n=50）（图1A，B）。此外，这两种颗粒类型的组合导致了异质团聚体的形成（图1C）。
图1 浓度为100mg/L的纳米颗粒（NP）溶液的TEM图像，包括（a）CeO2 NP、（B）氘标记的（DPS）NP和（C）二元NP混合物。CeO2、DPS及其混合物的平均流体动力学直径如（D）所示。
Accumulation and Translocation of Ce and DPS in Plants Ce和DPS在植物体内的积累和转运
CeO2、DPS及其混合物的14天叶面暴露导致Ce或DPS通过植物叶片吸收（图2）。在萝卜幼苗中，与单一CeO2处理（365±42μg/g）相比，混合处理后的Ce浓度（522±70μg/g）显著升高（p<0.05）。在单一CeO2处理和混合处理后分别为1.42±0.46和2.77±0.14（p<0.05）（表2）。这些结果表明，DPS的存在促进了叶片对Ce的吸收。
图2 通过叶面暴露CeO2和DPS纳米颗粒在樱桃萝卜中的吸收、转运和积累示意图（A）单一和混合暴露于CeO2和DPS纳米颗粒后，樱桃萝卜茎和根中Ce和DPS的含量（B）通过SP-ICP-MS测量的用CeO2 NP（C）和混合物NP（D）处理的樱桃萝卜茎和根中CeO2的粒度分布。
单一DPS暴露和混合暴露之间的比较表明，萝卜幼苗中DPS的浓度分别为275±49μg/g和311±54μg/g。在两种处理下，整个植物中DPS的BCF值分别为0.70±0.17和0.73±0.14。CeO2的存在不会显著改变植物对DPS的吸收。
混合暴露对叶片表面Ce和DPS吸收的不一致影响可归因于聚集引起的NP性质的变化。这些效应受到疏水性、π-π堆积和粒子之间静电相互作用的影响。在CeO2 DPS混合物溶液中，与单一CeO2或单一DPS分散体相比，ζ电位没有显著变化，而流体动力学直径明显小于单一CeO2溶液（p<0.05），与单一DPS悬浮液的流体动力学直径相似（图1D）。测试NP的电荷和大小被认为是限制叶片吸收的关键因素。植物的细胞壁和角质层通常带有负电荷，对正电荷的亲和力更高，正如Wang等人所证明的那样，其中带正电的PS（PS-NH3+）在莴苣叶中的积累比带负电的PS（PS-COO-）更多。如Li等人所观察到的，叶子施加的生物屏障限制了特定粒径的颗粒，其中较小尺寸的ZnO NP在水稻幼苗的细胞质中积累更多。这导致了更严重的细胞损伤，而较大尺寸的NP被有效阻断。因此，可以合理地推测，本研究中聚集体大小的变化可能会导致叶片吸收的差异。
叶片吸收后，Ce或DPS从地上部分转移到地下部分（图2）。在萝卜根中，单一CeO2处理的Ce浓度（1.47±0.38μg/g）显著低于混合处理（3.48±1.17μg/g）（p<0.05），而两种处理的TF保持在5.10×10-3左右。在单一DPS和混合处理中，各自的含量分别为4.26±1.15μg/g和5.56±1.48μg/g，各自的TF值分别为2.02×10-2和1.98×10-2。事实上，混合处理不会影响植物对铈或DPS的运输能力。此外，无论是单一处理还是混合处理，植物中Ce和DPS的转运因子都存在显著差异，表明DPS在樱桃萝卜中的转运更容易。这可能对理解各种NP在植物系统中的行为及其潜在的生态影响具有重要意义。
Trophic Transfer of Ce and DPS 铈和DPS的营养转移
纳米颗粒可以通过食物链进入并积聚在蜗牛的各个部位。为了量化NP，我们分析了解剖的蜗牛及其粪便（图3A）。结果显示，Ce和DPS在所有处理中都有积累（图3C）。在蜗牛的食物链中，与单一暴露相比，混合暴露显示壳和消化腺中的铈浓度升高。相比之下，在混合处理下，粪便中的DPS水平较高，外壳和软组织中的DPS含量较低。在根蜗牛食物链中，与单一处理相比，混合处理显示壳和软组织中的铈浓度增加。此外，混合处理后，壳、软组织和消化腺中的DPS浓度显著升高。观察到的模式表明，Ce在蜗牛体内的协同积累，这些蜗牛在茎和根途径中都食用了被混合NP污染的植物。
图3 实验照片展示了蜗牛被解剖成三个部分：壳、软组织和消化腺（a）Ce和DPS在以茎为食和以根为食的蜗牛的三个身体部位和粪便中的总质量比（B）和浓度（C）
总体而言，与NP的单一暴露相比，Ce和DPS的TTF值显示，在混合处理后，以茎为食的蜗牛总数显著下降。相比之下，对于整个食根蜗牛，与单一处理相比，混合处理后Ce的TTF值显著降低，而混合处理后DPS的TTF价值没有显著差异。此外，无论是否单独或混合暴露于CeO2或DPS，从根部到总蜗牛的TTF值都比从茎部到总蜗牛地TTF值高一个数量级。Ce和DPS的营养转移是由食物来源的类型具体驱动的。
在根饲蜗牛中，混合处理的壳、软组织和消化腺中DPS的TTF值高于单一DPS处理，但蜗牛DPS的整体TTF值没有差异。这种差异可归因于不同组织或器官内污染物吸收、分布、代谢和消除的动态过程，导致不同的积累模式。在所有处理中，粪便中Ce或DPS的TTF值比蜗牛其他部位的TTF值高1-2个数量级，表明蜗牛可以排泄通过食用植物捕获的CeO2和DPS。这一发现与之前对小白菜蜗牛中CeO2和生菜蜗牛食物链中聚苯乙烯的研究一致。特别是，TTF值大于1仅在食用暴露于混合物的萝卜根的蜗牛的消化腺（1.01±0.23）和软组织（1.32±0.18）中观察到，这表明营养转移介导的DPS生物放大作用源于NP在易位和混合NP相互作用过程中的变化。在这项研究中，假设污染物在生物群中达到吸收-排泄平衡，则采用14天的暴露时间。未来的研究应考虑延长暴露期，以充分评估和预测与目标污染物通过食物链的长期营养转移相关的生态风险。
总之，与单一处理相比，混合处理显著影响了Ce和DPS的营养转移。然而，根据食物链和所涉及的纳米材料的类型，这种转移可能会被促进或抑制。此外，接触混合物的影响在消费者的整体和局部方面可能并不一致。相反，之前构建生菜-蜗牛食物链的研究发现，生菜接触纳米银或纳米TiO2或其混合物不会影响银或钛的营养转移。这些相互矛盾的结果可归因于多种因素，包括物种变化、NP类型、大小和浓度以及环境影响。
一般来说，NPs由于其高表面积体积比而在热力学上是不稳定的。在本研究中，CeO2和DPS可能相互作用，并经历了溶解、吸附、螯合、聚集、分散等复杂的物理化学转化过程，从而影响其进一步的环境行为。例如，先前的研究表明，当纳米TiO2和纳米zno混合处理时，纳米TiO2对Zn2+的吸附减弱了纳米zno对细菌ATP水平的抑制作用。此外，也有报道称，纳米- ceo2和纳米- zno混合物对europaea亚硝化单胞菌具有更高的细胞毒性，这是由于这些不同的NPs与细胞之间的静电相互作用介导了增强的协同效应。这些相互作用在决定生物体内NPs混合物的行为方面起着至关重要的作用。然而，它们的影响可能因所涉及的具体材料而异，因为金属氧化物NPs通常比其他类型的NPs表现出更大的环境活性。这种可变性可以潜在地解释我们在研究中观察到的与NPs混合物暴露相关的营养转移效率波动。除了CeO2 NPs和DPS NPs之间的微观相互作用外，混合处理还可能通过改变蜗牛的行为来破坏营养转移效率。虽然在任何处理中都没有观察到蜗牛体重的变化，但在单一CeO2或DPS处理与混合处理之间，蜗牛的摄入和排泄率存在差异（图4）。NPs混合物的存在可能会影响植物性食物的可口性，从而对消费者的进食行为产生直接的负面影响。消费者摄食行为的抑制可能源于营养转移引起的NPs毒性。这强调了NPs的生态毒性，表明它们不仅可能破坏单个物种，而且可能破坏更广泛的食物链相互作用。此外，NPs混合物也可能影响植物，通过调节植物代谢间接改变消费者行为。在我们的研究中，CeO2、DPS或它们的混合物对樱桃萝卜茎和根矿质元素动态平衡的不同干扰表明植物代谢防御被激活。这种激活可能会影响蜗牛的行为，因为各种元素通过提供能量和作为酶成分在植物代谢中发挥重要作用。然而，需要进一步的代谢物数据来支持这一假设。
图4 摄食期内食茎蜗牛（A）和食根蜗牛（B）的食物摄入量、鲜重以及食芽蜗牛和食根螺（D）的干重粪便排泄量的变化
Biodistribution of NPs in Snails 纳米颗粒在蜗牛体内的生物分布
污染物在蜗牛体内的分布，如局部质量占其总质量的比例所示，表现出一种不同的模式，这取决于蜗牛是以嫩枝还是根部作为饮食来源（图3B）。具体来说，在单次处理中，Ce在茎饲蜗牛中的分布呈现出粪便（98.0%）>软组织（1.50%）>消化腺（0.25%）=壳（0.25%）的排序模式，而在混合处理中，排序模式转变为粪便（97.6%）>消化腺体（1.51%）>软组织（0.51%）>壳（0.38%）。在单一处理和混合处理中，DPS在食芽蜗牛中的分布与Ce保持相似。当暴露于CeO2和DPS NP的混合物中时，食用芽的蜗牛调整了Ce和DPS的分布策略，更多的Ce和DPS进入蜗牛消化腺而不是软组织。
在以根为食的蜗牛中，铈在单一处理和混合处理中的分布保持在粪便（CeO2处理：42.6%，混合处理：34.2%）>外壳（CeO2治疗：30.4%，混合治疗：31.1%）>软组织（CeO2待遇：22.8%，混合处理；23.0%）>消化腺（CeO2治疗：4.18%，混合治疗；11.8%）的相同顺序。在单次或混合治疗的情况下，DPS NP的内部分布保持不变，其排名为软组织（DPS治疗：39.7%，混合治疗：52.7%）>消化腺（DPS治疗；36.2%，混合治疗；26.4%）>粪便（DPS治疗）：25.8%，混合处理：19.4%）>外壳（DPS处理：0.12%，混合处理；1.58%）。与单次接触相比，当暴露于CeO2和DPS NP的混合物中时，食根蜗牛的分布模式保持不变。然而，在食根蜗牛中，Ce和DPS的生物分布模式存在显著差异。与Ce相比，DPS更有可能留在蜗牛体内，而不是通过粪便排出。
混合暴露明显提高了采食蜗牛体内Ce和DPS的AE值，同时降低了采食蜗牛体内DPS的AE值。重要的是，无论是单一暴露还是混合暴露，Ce和DPS对根食蜗牛的生物利用度都显著高于对芽食蜗牛的生物利用度，显示出AE值的数量级差异。这强调了一个一致的趋势：NPs的生物利用度在其从茎转移到根后显着增加。几种因素可能导致观察到的生物利用度差异。首先，芽和根中NPs形态特性的差异可能影响其生物利用度。在叶片吸收和转运过程中，大小排斥限制可能会阻止较大的单个氮素或团聚体到达根部。分散在萝卜根中的纳米颗粒可能取决于更小的尺寸，更有可能被转移到蜗牛体内而不是被排出体外。此外，体外跟踪模拟表明，模拟木质部汁液中发生了CeO2 NPs的溶解和Ce离子的释放。这些结果与先前的研究一致，表明叶片内NP形式的CeO2可能在运输过程中或到达根部后发生部分溶解。虽然目前缺乏关于植物DPS变化的实验证据，但这种转运过程中的转化似乎对NPs的生物利用度至关重要。其次，食物质地对NPs的生物利用度有显著影响。与樱桃萝卜相比，含有难以消化的木质化纤维的主根在蜗牛的胃肠道中停留时间更长。这种延长的停留时间可能有助于将更多的NPs释放到蜗牛的消化系统中。此外，植物根系中储存的某些还原性代谢物以及植物合成的特定代谢性抗氧化化合物，如还原糖、黄酮类化合物和抗坏血酸等，可能在NPs生物转化过程中触发氧化还原反应，从而增强蜗牛对NPs的吸收和利用。最后，当NPs进入植物体内时，它们会选择性地吸附周围复杂生理流体环境中的生物分子。这一过程形成了由蛋白质、脂质、糖、核酸和天然有机化合物组成的冠状体。这种生物冕赋予NPs不同于其“合成特性”的“生物学特性”，随后影响NPs在生物体中的细胞内化、分布和积累。
Environmental Implications
本研究首次定量分析了CeO2、DPS及其混合物在樱桃萝卜蜗牛食物链中的积累、营养转移和生物分布。在空气中纳米塑料污染日益严重和农业中纳米技术蓬勃发展的背景下，我们的研究发现，叶面暴露是NP通过食物链转移的关键途径。本研究表明，混合NP暴露模式对樱桃萝卜和蜗牛对Ce和DPS的吸收和分布的影响不一致。有必要进一步探索，以了解推动NP营养转移的机制，特别是在混合物暴露的情况下。此外，尽管NP的累积量在运输到植物根部后减少，但它显著改变了它们在较高营养水平下的生物分布模式，导致NP在生物体内的累积量增加，而不是通过粪便排泄。观察到的生物放大、蜗牛行为的变化以及植物和动物元素平衡的紊乱凸显了进行更全面研究的必要性，以了解与NP营养转移相关的生态风险。
🌍欢迎关注 ENV.One Health🌍
