Insights into the Chemical Exposome during Pregnancy: A Non-Targeted Analysis of Preterm and Term Births
妊娠期化学物质暴露的见解：早产和足月分娩的非靶向分析
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第一作者：Xiaowen Ji (New York University)
通讯作者：Xiaowen Ji, Dimitri Abrahamsson(New York University)
本研究对纽约大学儿童健康与环境研究中收集的95对产前尿液和血清样本（35对早产儿）应用非靶向分析，调查了纽约市孕妇的化学物质暴露情况。共检测到1524种化学特征进行标注，其中12种化学特征通过了真实标准的确认。两种已证实的化学物质十二烷基三甲基铵和N，N-二甲基癸胺N-氧化物在人类血液样本中似乎以前没有报道过。我们观察到尿液和血清样本之间，以及早产和足月血清样本之间的富集差异具有统计学意义（p < 0.0001）。早产儿与足月比较，外源性污染物1,4-环己二羧酸（暂定）在早产儿血清中丰度更高，差异有统计学意义（p = 0.003）。观察到的化学关联的一个例子（总共12种关联）是表面活性剂（叔胺）和内源性代谢物（脂肪酸酰胺）之间的关联。Synopsis
Non-targeted analysis of urine and serum samples from pregnant women reveals a potential link between environmental contaminants and preterm birth.
对孕妇尿液和血清样本的非靶向分析揭示了环境污染物与早产之间的潜在联系。
人类已经通过接触消费品、包装和加工食品、受污染的饮用水和受污染的空气接触到各种合成化学物质，而且这个数字还在不断增加。这些化学物质中的许多可能会被人体吸收，并可能对人类健康构成威胁。此外，当这些化学物质暴露在不同的环境中时，新的化合物，也称为转化产物，可能会通过生物和非生物过程形成。在过去40年里，19个国家和地区约有350000种注册化学物质用于商业生产和使用。 此外，美国环境保护局（US EPA）在EPA的CompTox化学品仪表板上列出了超过1218248种具有环境重要性的化学品。最近的估计表明，只有10%的慢性人类疾病可以归因于遗传，剩下的90%可能至少部分与环境因素有关。孕妇经常接触周围环境中的人为化学品，这可能会对母亲和胎儿产生不利影响。先前的研究强调，母亲接触环境污染物会增加肥胖、哮喘和后代各种疾病的风险，包括早产。 暴露时间也是一个重要因素，因为暴露的影响可能取决于它所伴随的发育过程。流行病学证据表明，在孕前和出生之间的任何时候接触环境污染物都会限制胎儿的生长，导致胎儿无法达到其全部生长潜力（出生体重低于预期）。 胎儿大脑特别容易在产前暴露于内分泌干扰化学物质，因为神经形成和神经元增殖在妊娠早期就开始了，而其他过程，如神经迁移、髓鞘形成、突触发生和凋亡，则开始中胚层并迅速持续到出生。研究关键窗口期间的化学暴露可以提供对潜在生物学机制的见解。
对人体样本中污染物的传统监测依赖于先前的假设、分析标准的可用性和经过验证的色谱方法的存在。美国国家健康与营养检查调查（NHANES）定期在人体样本（如全血、血清和尿液）中测量约450种环境化学物质。这仅占美国联邦有毒物质控制法（TSCA）和美国环保署CompTox化学品仪表板所列化学品的约0.5%和0.04%。这种传统方法无法捕捉到化学暴露的全部情况，因此可能会错过与各种健康结果的重要关联。高分辨率质谱（HRMS）的进步提高了我们在一次运行中分析数千种不同化学物质的能力，因为它具有高分辨率（在m/z 200>30000）、质量精度（1-5ppm）和高扫描速度（12Hz）。结合气相色谱或液相色谱（GC/LC）等预分离技术，HRMS在检测各个领域的未知化学物质方面显示出巨大的前景。近年来，使用HRMS的非靶向分析（NTA）已成功用于筛查人体样本，从而发现了许多外源化合物（如农药代谢物、内分泌干扰化合物以及聚全氟烷基和全氟烷基物质）。许多关于未知化合物的研究都集中在可疑清单中假定的可能化合物上（可疑筛查分析，SSA）。然而，在NTA中，未知化合物没有这样的可疑清单。目前，在公共卫生研究中，非常需要应用NTA来表征不同的暴露途径。
基于之前的NTA方法，我们开发了一个工作流程，全面分析来自纽约市种族和社会经济多样化孕妇样本的生物样本中所有可检测的化学暴露和代谢物。本研究的目的有三：（1）使用NTA分析95对孕妇的血清和尿液样本，并研究其化学暴露情况；（2）表征每种生物样本类型内、早产和足月分娩之间尿液和血清之间化学富集的差异；（3）探索内源性代谢物与外源性化学物质的关联。我们观察到，在早产样本的血清和尿液中，所有外源性污染物（1-2级）的检测频率更高。我们发现，在早产样本中，血清和尿液中更频繁地检测到四种已确认的化学物质（2-苯基吲哚、N，N-二甲基癸胺、丙环唑和三异丙醇胺）（图1）。图1 早产和足月分娩样本中归类为外源性污染物的注释化学物质（1级和2级）的检测频率（%）：血清（a）和尿液（b）在早产中检测频率较高的化学物质。红色的化学名称代表真实标准中确认的化学物质（1级）。
在血清中，早产和足月分娩样本之间观察到不同化学物质的富集（图2a）。批量校正后，早产和足月分娩样本之间PC1负荷的统计差异显著（p<0.0001）。在早产和足月分娩样本之间1547个显著不同的LC-MS特征中（p<0.05）。下调区域中的注释化学品有聚乙二醇（PEG）n6（m/z:283.1755[m+H+]）和中心铵（m/z:2084.3313[m+H+]）（图3a）。在上调区域的那些具有N-乙酰组氨酸（m/z:198.0848[m+H+]）和脱氧胆酸（m/z:391.2858[m-H-]）。上调区域中的注释化学物质包括外源污染物（1,4-环己烷二羧酸，m/z:173.0783[m+H+]）和其他七种被确定为天然产物、药物和内源性代谢物的化合物。对于那些处于下调区域的化合物，它们包括内源性代谢物、外源性污染物、药物和个人护理产品。根据样本的化学特征，我们仅能够在血清中区分早产和足月分娩（图2a）。早产是一种发病机制复杂的疾病。与对照样本相比，之前的报告显示了环境污染物与早产的潜在关联，例如杀虫剂滴滴涕（二氯二苯三氯乙烷）、铅和邻苯二甲酸酯。对于邻苯二甲酸酯，早产样本中发现了邻苯二酸二庚酯（2级）。这并不奇怪，因为邻苯二甲酸酯在增塑剂行业中得到了广泛的应用，并且在亚洲和北美的成人和儿童的人体样本中也检测到了邻苯二酸酯。虽然之前的研究报告了邻苯二甲酸酯及其代谢产物与纽约市其他妊娠队列中的胎龄之间的显著关联，但我们无法在血液或尿液样本中发现早产和足月分娩之间的任何化学特征关联。由于样本数量有限，我们没有进一步阐明这一观察结果。应该指出的是，邻苯二甲酸酯无处不在，可以从医疗用品和实验室设备中浸出，正如我们目前的原始数据集所示，许多邻苯二酸盐存在于实验室控制甚至溶剂空白中，使来源识别复杂。因此，我们不会进一步推测样品中邻苯二甲酸二庚酯的来源。![]()
图2 血清和尿液样本批量效应校正后的聚类热图。化学特征显示，经过多次检测校正（Benjamini-Hochberg检验，5%的假发现率）后，血清样本（a）和尿液样本（b）在早产和足月分娩中的富集程度不同。方框的底部和顶部表示第25和第75个百分位数，误差条表示第10到第90个百分位，实线表示中值。
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图3 ESI+和ESI-模式的对数转换比率和化学特征的相应p值的火山图，截止频率为70%，说明了数据：早产和足月分娩在血清（a）和尿液（b）中的化学特征的统计差异。水平虚线表示对数p值的截止值（p<0.05），垂直虚线表示倍数变化的截止值。
在尿液中，我们没有观察到早产和足月分娩样本之间存在明显的化学富集（图2b），尽管PC1负荷存在显著差异（p<0.0001）。在早产和足月分娩样本之间9225个显著不同的LC-MS特征中（p<0.05），427个特征中有19个被初步注释，它们都位于下调区域。其中一些标注的特征如火山图所示，例如，二癸基二甲基铵（m/z:326.3782[m+H]+）和腺苷（m/z:268.1002[m+H]+）（图3b）。注释化学物质中数量最多的是内源性代谢物和外源污染物。在血清中，在早产样本中特征显著不同（p<0.05）且丰度比足月出生样本高1.2倍的所有注释化学物质中（图3a），只有1,4-环己烷二羧酸被归类为外源性污染物。这种化合物用于生产尼龙和聚酯树脂，用于各种目的，如提高塑化效率和硬度。我们推测，含有这种化合物的产品可能会通过摄入和吸入被人体吸收。虽然1,4-环己烷二羧酸目前在TSCA下，但它没有列入BED。据我们所知，没有研究报告在人体样本中检测到1,4-环己烷二羧酸。关于内源性代谢物，脱氧胆酸是一种胆汁酸，是早产儿胎粪中存在的主要胆汁酸之一，通过胎盘转移进入胎儿。最近的研究还表明，总胆汁酸的变化与早产率直接相关。对于早产样本中存在显著差异（p<0.05）的注释化学物质，与足月分娩样本相比，其丰度较低，我们在血清中发现了两种外源性污染物，在尿液中发现了六种。然而，在早产样本或尿液或血清中，这些污染物的检测频率并不高。这些化学物质的负倍数变化可能归因于与内源性代谢物相比的单个样本变化以及尿液采样时间的差异。内源性代谢物和外源化学物质之间显著关联的分子网络如图4所示。内源性外源性化合物相关性包括d-鞘氨醇与N-甲基二辛胺、十八胺和双（2-乙基己基）胺。十八胺（伯胺）和双（2-乙基己基）胺（叔胺）等胺化合物显示出显著的关联。其他相关性涉及R-棕榈酰-（2-甲基）乙醇酰胺和中心铵，以及油酰胺与双（2-乙基己基）胺和双（2-甲基己基）胺以及十二烷基三甲基铵，早产发生率略高（约53%）。PEG n5与内源性代谢产物2,3-二羟丙基12-甲基十三烷酸酯呈正相关。柠檬酸与两种内源性代谢产物异柠檬酸和1,3,4,5-四羟基环己烷羧酸呈正相关。![]()
图4 血清样本中内源性（红色）和外源性化合物特征（绿色）的分子相互作用网络（N=95）。该网络表明，MSn的特征得分为50，覆盖值为70，最小片段数为3。网络中的相关性R值>0.5。网络中显示的相关性都是正的（棕色线）。线的粗细表示相关性的强度。红色圆圈和绿色圆圈分别代表内源性和外源性化合物。蓝色圆圈代表未知的化学物质。圆圈的大小表示化学特征的集成区域的大小。根据Schymanski、Jeon、Gulde、Fenner、Ruff、Singer和Hollender的注释置信度，内源性和外源性化合物属于2级，未知化合物属于3级。饼图显示了所有检测到外源性化合物的血清样本中与这些化合物相关的早产和足月分娩的平均百分比，例如聚乙二醇化合物（PEG）的平均百分比。
根据我们对BED和HMD的搜索，在已确认的化合物中，十二烷基三甲基铵和N，N-二甲基癸胺N-氧化物这两种化学物质广泛用于PCP和各种工业产品的表面活性剂，似乎以前从未在人体样本中报告过。此外，我们发现唑类杀菌剂丙环唑是一种大量使用的农业药剂，对人类具有致癌和内分泌干扰作用。三种叔胺化合物（三异丙醇胺、三丁胺、二苯胺）用于许多工业应用，如表面活性剂和稳定剂，二苯胺及其衍生物被欧盟列为专有污染物。发现两种磷酸酯阻燃剂，磷酸三丁酯和磷酸三异丁酯，与成对的尿液样本相比，血清样本的检测率和平均浓度更高。这与之前的报告相似，在之前的报告中，磷酸三丁酯是中国北京和深圳血液样本中的主要物质。然而，人体样本中尚未报告磷酸三异丁酯。在化妆品等PCP中发现的2,2,6,6-四甲基-4-哌啶醇在人体血液中被检测到。4-硝基苯酚，有机磷农药甲基对硫磷的代谢产物，在美国被非法用于家庭内部，我们的样本中也检测到了它。氨基酚及其衍生物在染料、石油添加剂和制药工业中具有重要的商业意义。有趣的是，我们的样本中没有检测到常用的4-氨基苯酚，而我们检测到的2-和3-氨基苯酚在人体样本中的报告频率较低。所有样本对均发现2-氨基酚和3-氨基酚在尿液和血清之间具有良好的相关性（R2=0.988），这表明暴露于孕妇的产品可能同时含有这两种氨基酚。我们还发现，327种化学物质中有39种未包含在BED中。在这些化学物质中，除十二烷基三甲基铵（1级）外，香茅醛（2级）被注释为外源污染物和五氯苯酚，但不包括在HMD和BED中。根据BED的血纸计数，几种化合物的研究数量非常有限：十二烷基三甲基铵、N，N-二甲基癸胺N-氧化物、三异丙醇胺和三丁胺此外，我们还确定了11种具有类似有限研究编号的初步注释化合物。这些化合物需要进一步研究以确定它们在人体中的存在。我们还观察到，腺苷（一种内源性代谢产物）在早产中存在显著差异，其在血清和尿液样本中的丰度均降低。腺苷是一种常见的内源性核苷，通常可以抵消ATP诱导的作用，如炎症。已经证明，在正常妊娠期间，由于血小板活化和核苷酶活性升高，腺苷水平会升高。有趣的是，腺苷是氧化应激的标志物，与没有这种情况的孕妇相比，患有先兆子痫的孕妇的腺苷水平明显更高。尿液和血清中腺苷水平较低可能与早产结局有关。尽管内源性代谢物不是本研究的主要焦点，但与早产相关的腺苷水平尚未有报道。这值得研究人员进一步关注，特别是因为腺苷也被用作治疗妊娠期室上性心动过速的药物。一般来说，我们在血清样本中观察到更广泛的内源性和外源性化学物质。这允许识别生物标志物化学物质和外源污染物。尽管如此，一些外源性污染物，如中心铵，在尿液样本中更为富集。我们发现，配对的产前尿液和血清样本具有不同的化学特征富集，尽管一些内源性化学物质在血清样本中的比例明显更高。在我们检测到的初步鉴定的化合物中，许多是内源性化合物或药物及其转化产物，是人体代谢的一部分。一些内源性化学物质与血清中的外源性污染物有关。例如，对甲酚硫酸盐（p-CS）与4-苯酚磺酸（4-PSA）和4-（羟甲基）苯磺酸（4-HMBSA）相关（图4）。p-CS是一种原型蛋白结合分子，来源于对甲酚的次级代谢，其中浓度增加可能与肾功能恶化有关。4-PSA是表面活性剂、洗涤剂、药品和染料的常见中间体/组分。4-HMBSA是取代苯磺酸的衍生物，广泛用作有机化合物合成的中间体。4-PSA已被列入ToxCast数据库，但4-PSA和4-HMBSA对人体的毒性尚不清楚。在当前的网络中，观察到PEG之间存在显著关系，PEG由具有重复乙二醇单元的聚醚化合物组成。聚乙二醇被用作药物和PCP的成分。观察到PEG-n5与2,3-二羟基丙基12-甲基十三烷酸酯（12-甲基十二烷酸酯脂肪酸链的内源性代谢产物）和癌症中复杂的微球相关代谢产物具有正连接。只有高分子量PEG（>400Da，例如PEG n8）在动物中显示出毒性作用，我们无法找到这些PEG的任何毒性研究。在一组用作化学中间体/表面活性剂的叔胺化合物之间观察到了另一个有趣的相关性，这些化合物的质量缺陷为−CH2-基团（14.0115 Da），例如中心铵和十八胺，以及脂肪酸酰胺（油酰胺）和生物活性脂质代谢物（d-鞘氨醇和R-棕榈酰-（2-甲基）乙醇酰胺）（图4）。这表明这些胺化合物可能会干扰脂质和脂肪酸代谢。相关报告指出，表面活性剂溶解脂质膜并将其转化为脂质表面活性剂胶束，而脂肪酸将脂质转化为立方相和六方相。所有这些关联都表明外源污染物对人体代谢过程的潜在直接或间接干预。在我们的数据集中，由于缺乏分析标准，大多数带注释的化学特征无法得到充分证实。内源性代谢物和外源性污染物组中的化合物明显多于药物、天然产品和个人护理产品。鉴于环境污染物的丰富性及其与内源性代谢物的关联，其中许多污染物可能会对暴露体产生重大影响，从而干扰脂质代谢和炎症调节等代谢途径。Limitations and Recommendations
虽然我们的研究提供了一些将化学物质暴露与早产联系起来的证据，但我们的研究不是一项全面的流行病学研究，而是一项人类暴露研究。我们的主要目标是识别在人类样本中未检测到的外源性污染物，并强调它们对人类的潜在不良影响，如孕妇早产。我们的研究有六个需要承认的局限性：
我们仅限于95名参与者，他们有成对的尿液和血清样本（包括35对早产儿样本）。尽管数据集有限，但它不会影响注释工作流程。建议使用更大的样本量，以建立早产孕妇体内污染物和内源性代谢物之间的强关联，并探索哪些孕妇群体的外源性污染物检测频率更高或更低。
尽管我们在早产和足月分娩之间的化学检测频率截止值为70%（以及60%和80%）时观察到血清热图中的聚集，但在60-80%的检测频率范围内，我们没有在成对的尿液样本中观察到类似的化学富集模式（图3b）。这种差异可能是由于尿液的采样时间不同以及尿液中更明显的基质效应。
LC-MS运行中QC化合物的RT（1.5-23.1分钟）通常跨越了总运行时间的大部分（0-25分钟）。然而，由于复杂样品中存在的多种化合物的物理化学性质不同，特别是对于早期洗脱的极性分子，51种QC化合物无法代表非靶向分析期间从LC柱洗脱的所有化合物。这些质量控制化合物仅用于评估每批运行中的仪器稳定性。我们还缺乏内部标准来提高半定量的准确性，这需要进一步的研究来提高。
大约22%的特征（等级≥3）通过与光谱数据库匹配进行了初步注释，12种化学物质得到了真实标准的确认。与早产和足月分娩之间差异丰富的化学特征相比，这些注释的化学物质也显示出显著的数据差距。我们建议进一步开发其他可疑或非靶向筛查方法，以确定各组之间存在显著差异的化学特征。
分析仪器带来了与不同质谱仪和制造商之间不同设置参数相关的挑战，特别是对于软电离技术。在非靶向分析（NTA）中，特定质量可能无法达到所需的质量分辨率。对于NTA中的Orbitrap HRMS，质量分辨率的上限可能会导致离子损失和振荡失相。在我们的研究中，每单位时间进入C阱（AGC靶）的离子数量有限，可能会显著影响检测频率较低的小分子化学物质的灵敏度。我们建议使用动态MS2数据窗口对合并样本进行不同质量范围的多次扫描，以减轻每次扫描的有限AGC目标。此外，建议结合各种分析方法来扩大化学空间覆盖范围，例如将挥发性和高度非极性化学物质的GC分离与四极杆飞行时间（QTOF）MS结合使用。
考虑到化合物的正负电离能力范围更广，进一步的研究应包括使用中性或碱性流动相条件进行第二次注射，以扩大化学覆盖范围。
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