EHDPP作为一种有机磷阻燃剂在电气和纺织工业中得到了广泛的应用。由于其过度使用，EHDPP在环境介质中无处不在。EHDPP具有很强的亲脂性（LogKow=5.73），远高于大多数OPFR和部分BFR。许多细胞实验证实了EHDPP对体外生物代谢的破坏作用，以及通过内分泌干扰影响鱼类的繁殖行为而产生生殖毒性。然而，关于EHDPP对水生生物的神经毒性的数据很少。EHDPP影响多巴胺系统，反映了斑马鱼摄食行为的变化。除了AChE抑制外，EHDPP还可以通过各种生物途径破坏神经发育和行为，可能类似于某些OPFR，包括破坏谷氨酸和γ-氨基丁酸（GABA）以及内分泌系统。然而，EHDPP诱导的神经系统疾病的详细分子机制尚不清楚。

早期生命阶段是环境污染物毒性暴露的敏感窗口，反映在婴儿比成人更容易患病。 作为一个脆弱的生命阶段，婴儿的代谢系统和血脑屏障（BBB）尚未完全成熟，因此更容易受到外源性污染物的影响。 先前的研究表明，在胎盘中检测到EHDPP的中位浓度为13.6ng/g（dw），在绒毛膜中5.96ng/g dw，在母乳中844pg/mL，这增加了婴儿的暴露风险。口腔接触仍然是幼儿的关键途径，使用含有EHDPP的婴儿和家用产品可能会导致更高水平的接触。 在OPFR中，EHDPP在香港幼儿园儿童尿液样本中的检出率（84%）和浓度（9.8μg/L）最高。 此外，EHDPP的主要代谢产物已被证实与儿童焦虑、抑郁、躯体化、攻击性和多动有关。 尽管如此，关于EHDPP对婴儿和成人的慢性毒性影响的数据很少，这表明其不良影响被严重低估了。关于EHDPP暴露是否参与细胞内Ca2+的调节并进一步促进AD的发生和进展，目前尚缺乏相关结论。

本研究在此评估了环境相关浓度暴露下EHDPP对斑马鱼中枢神经系统（CNS）的早期影响。行为和转录组分析都得出了令人信服的证据，表明低剂量EHDPP暴露会导致幼虫产生兴奋毒性。此外，由于生命早期的脆弱性，我们严格研究了早期暴露于EHDPP对成鱼运动行为和大脑超微结构的长期影响。这些观察结果提供了关键证据，表明在敏感阶段接触EHDPP对成人健康构成持久威胁，也为AD的诊断、治疗和预防奠定了理论基础。

首先利用Swiss Target Prediction软件预测EHDPP影响的潜在大分子靶点。发现大分子靶点在阿尔茨海默病等脑部疾病显著富集（Figure 1A）。KEGG信号通路注释揭示了EHDPP对“Neuroactive ligand–receptor interaction”的潜在干扰，扰乱了正常的钙和cAMP信号传导。GO分析进一步揭示了主要涉及神经递质受体活性和钙离子稳态（Figure 1C）。这些发现表明，EHDPP靶向与神经系统发育相关的生物大分子，从而对神经系统疾病构成风险。此外，破坏神经递质和钙信号通路是导致EHDPP诱导神经毒性的关键机制。

Figure 1  EHDPP exposure induced hyperactivity in larvae. Target gene prediction of EHDPP. (A) DO enrichment. (B) KEGG enrichment. (C) GO enrichment. (D) Velocity of 120-hpf larvae placed individually in a 48-well plate (9.8 mm diameter per well). (E) Motion time. (F) Rotation angle. (G) Locomotor activity of 120-hpf larvae in response to alternating light/dark conditions. (H) Average distance traveled. 

• EHDPP Exposure Altered Larval Zebrafish Behavior EHDPP暴露改变仔鱼行为

随后进行了一系列行为学实验（Figure1 D-H），暴露于EHDPP会增强幼虫对光暗刺激反应的敏感性，并导致斑马鱼恐慌和休克。行为观察表明与上述靶点预测一致，表明EHDPP具有神经毒性作用。

• EHDPP Exposure Induced Calcium Overload, Neurotransmitter Homeostasis Disruption, and Mitochondrial Dysfunction EHDPP暴露诱导钙超载、神经递质稳态紊乱和线粒体功能障碍

由于EHDPP的兴奋性神经毒性，在暴露于5μg/L EHDPP后，对120 hpf的斑马鱼幼鱼进行了RNA测序，以探索潜在的毒性机制。DEGs上的KEGG注释揭示了活化钙信号通路的显著富集，与靶点预测一致（图2A）。EHDPP暴露还抑制了物质代谢、能量代谢途径（包括外源代谢、氨基酸代谢和氧化磷酸化）和紧密连接完整性。通过细胞成分（CC）注释，发现DEGs主要位于细胞结构中，特别是细胞膜和线粒体膜中（图2B）。基因集富集分析（GSEA）显示了“组胺H2受体介导的信号通路”、“异三聚体G蛋白信号通路”，“5HT1型受体介导信号通路”和“代谢型谷氨酸受体群通路”、”钙粘蛋白信号通路“、”毒蕈碱乙酰胆碱受体信号通路“和”阿尔茨海默病早老素通路“的总体上调趋势（图2C）。除了钙依赖性蛋白钙粘蛋白外，其他途径还涉及调节细胞内钙以影响下游过程的G蛋白偶联受体（GPCR）。总体而言，RNA-seq和生物信息学分析与靶标预测一致，表明EHDPP有诱导阿尔茨海默病和失调钙信号通路的趋势。

图2 EHDPP暴露会引发线粒体功能障碍，破坏Ca2+和神经递质稳态。（A） KEGG分别富集上调和下调的DEGs。方形大小表示基因数量，方形颜色表示p值。（B） GO分析中所有DEG的细胞成分注释结果。（C） 通过Panther数据库注释的所有基因的GSEA分析。（D） 斑马鱼幼体脑采样示意图。（E） JC-1染色的代表性图像。（F） 红色与绿色荧光强度之比。（G） 120 hpf幼虫脑内ATP含量。（H） 120 hpf幼虫大脑中Ca2+的相对水平。（I-K）120 hpf幼虫脑中DA、5-HT和ACh的水平。

   暴露120小时后，暴露于0.5和5μg/L的仔鱼头部检测到EHDPP浓度分别为4.74±1.12和21.59±8.00 ng/g w.w。与对照组组相比，暴露于高浓度EHDPP的仔鱼大脑中的绿色荧光显著增加，红色荧光相应减少，表明MMP显著降低。相应地，在5μg/L的处理中，脑ATP含量急剧下降，表明仔鱼脑能量合成代谢异常（图2G）。细胞能量失衡会影响细胞间能量流动、信号转导和细胞间通讯。在脑组织中，钙离子和神经递质起信使作用，参与调节细胞活动和功能。尽管暴露于0.05μg/L EHDPP不会影响120 hpf幼虫脑中的Ca2+水平或神经递质，但在0.5μg/L EHDPP暴露后，观察到Ca2+和5-HT水平显著升高。此外，与SC组相比，5.0-μg/L EHDPP暴露导致Ca2+、DA和5-HT水平显著升高（图2H-J）。5μg/L EHDPP诱导的乙酰胆碱水平升高，这表明EHDPP对AChE的抑制作用与ACh对AChEs活性的调节之间存在动态平衡和补偿相互作用。结合靶点预测和RNA测序的结果，我们假设钙超载介导的神经递质释放和细胞兴奋性升高可能是EHDPP诱导的幼虫行为变化的潜在因素。

环境污染物对细胞内Ca2+的干扰已成为毒性领域的研究热点。脑神经元中Ca2+振荡的增加被证实是环境神经毒素神经毒性作用的潜在途径，涉及突触发生的增加和神经递质的过度释放。在此，EHDPP暴露浓度设定为0.05、0.5和5.0μg/L，均在环境监测水平范围内。尽管这些微量水平不足以对AChE活性产生抑制作用，但与低剂量的有机磷农药类似，出乎意料的是，当暴露于5.0μg/L EHDPP时，幼虫大脑中的ACh水平显著增加。这表明EHDPP对AChE的抑制作用与ACh调节AChE活性之间存在动态平衡和补偿相互作用。除了DA和5-HT，参与运动调节的神经递质在暴露于EHDPP后也显著增加。到目前为止，许多研究已经将钙信号传导与DA和5-HT联系起来，因此突触5-HT水平的提高通过增加突触Ca2+活性来改善行为缺陷。此外，Ca2+的过度激活会增强DA信号传导，从而驱动运动行为。因此，斑马鱼受Ca2+通道调节的异常行为是EHDPP暴露引发的潜在神经毒性机制的综合反映。

Ca2+超载，伴随着EHDPP暴露后MMP和ATP水平的降低，表明仔鱼大脑中存在全面的线粒体功能障碍。分子水平的转录组学分析进一步揭示了关键线粒体生物学功能的抑制，显示了氧化磷酸化和氨基酸代谢的下调，这导致了ATP水平的降低。值得注意的是，静息条件下细胞中持续的Ca2+积累意味着阳离子动力学的恶性循环，进一步导致大量的能量消耗。另一方面，当神经元受到强烈刺激时，充足的ATP供应对于维持高水平的突触传递和幼虫运动活动至关重要，线粒体支持的减少进一步加剧了ATP的耗竭。

• Competitive Binding and Activation of mAChRs by EHDPP EHDPP对mAChRs的竞争性结合和激活

外源性化学物质可以直接影响细胞膜中的离子通道蛋白和受体，或影响内质网或线粒体的功能，从而激活细胞内钙信号传导。为了确定EHDPP的靶分子，对这117种蛋白质进行了分子对接模拟。其中，67种蛋白质显示出与EHDPP的结合亲和力，结合能低于-5.0 kJ/mol，如热图所示。GPCR超家族，特别是mAChR异构体（M1-M5），其途径在EHDPP处理下高度富集（图2C），与EHDPP表现出最强的亲和力（图3A）。值得注意的是，即使在0.5μg/L的治疗组中，与SC组相比，chrm5a的表达显著升高，高达37.5%（图3B）。全身蛋白质的蛋白质印迹分析显示，与SC组相比，5μg/L暴露组的CHRM1、CHRM2和CHRM5的表达分别显著增加了80.9%、73.41%和62.13%（图3C、D）。仔鱼的免疫荧光染色显示CHRM在神经组织内表达，特别是在位于大脑、眼睛和脊髓外侧的神经元细胞质中。从背侧对大脑区域的分析显示，与SC组相比，CHRM5显著增加了38.9%，CHRM1增加了30.0%（图3E，F）。这些发现表明，EHDPP可以竞争性地结合内源性受体，特别是大脑中乙酰胆碱的毒蕈碱M1和M5受体，从而导致酶底物结合的竞争性抑制，这可能会产生“连锁”效应，如Ca2+超载应激（图3G）。

图3 EHDPP暴露激活斑马鱼脑中的mAChRs。（A） 热图显示了EHDPP与钙信号通路上游蛋白质之间的结合亲和力。仅显示了与EHDPP结合亲和力小于-5 kJ/mol的蛋白质。（B） 在EHDPP暴露下，120 hpf幼虫脑中与mAChRs（M1-M5）相对应的mRNA的相对表达水平。（C） 对整个120 hpf幼虫提取物中的蛋白质CHRM1、CHRM2和CHRM5进行蛋白质印迹分析。（D） 使用ImageJ定量蛋白质强度。（E） 120 hpf幼虫大脑中CHRM1、CHRM2和CHRM5的代表性全套免疫染色图像。（F） 大脑中荧光强度的量化。（G） 图示EHDPP暴露引起的异常运动行为的机制。

同源建模和分子对接揭示了mAChRs和EHDPP之间的强亲和力，这进一步得到了相应基因和蛋白质上调的证实。在EHDPP暴露下，证实了斑马鱼幼鱼中mAChRs的过度调节，因此EHDPP激活mAChRs可以被认为是导致脑细胞Ca2+超载的主要危险因素。

• Comparison of DEGs from AD and RNA-seq under EHDPP Exposure EHDPP暴露下AD和RNA-seq DEGs的比较

为了进一步阐明EHDPP的潜在神经风险，对GEO数据库（GSE48350）中获得的AD患者DEGs的表达谱进行了分析。KEGG对DEGs的注释揭示了AD患者大脑中多种信号通路的中断。在EHDPP处理的斑马鱼中，有几种途径与RNA-seq发现有共同之处，如钙信号通路、MAPK信号通路、心肌细胞中的肾上腺素能信号通路和紧密连接（图4A）。此外，GSEA表明AD患者的氧化磷酸化过程中断，钙信号通路显著富集（图4B），在暴露于EHDPP的斑马鱼中也观察到了这种模式。Pearson相关分析显示，绿松石模块与AD特征的相关性最强（图4C），共包含2458个基因。通过设定GS>0.5和MM>0.8的阈值，筛选出995个基因（图4D）。KEGG注释表明，这995个基因在突触通路中显著富集，包括GABA能突触和多巴胺能突触（图4E）。这些结果强调了各种突触类型和相应的神经递质释放和作用在AD发病机制中的参与。此外，钙信号通路的富集进一步强调了其在AD病理中的关键调节作用。鉴于在暴露于EHDPP的仔鱼中观察到类似的异常钙信号，可以合理地推测EHDPP具有诱导AD样病理的高风险。

图4。人类RNA微阵列测序数据揭示了钙信号通路在AD发病机制中的作用。（A）KEGG富集DEGs，仅显示出明显不同的通路。（B） GSEA分析，仅显示排名前15的路径。（C） 分析模块间的相关性以及AD特征与各模块之间的相关性。（D，E）绿松石模块中中枢基因的鉴定和已鉴定中枢基因的功能分析。仅显示排名前10的路径。

• EHDPP Exposure during Early Developmental Stage Triggers AD-like Symptoms in Adult Zebrafish 发育早期暴露于EHDPP会引发成年斑马鱼AD样症状

鉴于AD样病理通常发生在老年人身上，我们进一步探讨了5μg/L EHDPP暴露对斑马鱼从早期仔鱼发育（4-120 hpf）到成年（180 dpf）的长期影响。同时，暴露于AlCl3溶液（100μg/L）30天的成年斑马鱼作为阳性对照。正如我们所预期的那样，与SC组相比，阳性对照组的斑马鱼在探索食物奖励区所花费的时间显著减少（图5A）。同样，成年斑马鱼在幼虫时期接触EHDPP后，其认知能力显著降低，与阳性对照组相似，表明早期接触EHDPP导致成年斑马鱼类认知功能下降。添加AD治疗药物（多奈哌齐，DPZ）可以挽救EHDPP引起的认知障碍。在圆形水箱中，阳性对照组（AlCl3处理）的斑马鱼表现出躁狂行为，这是由于它们在镜子中看到自己的反射，在攻击区徘徊，并反复用头与水箱壁碰撞而引发的。与SC组相比，暴露于4至120 hpf EHDPP的成年斑马鱼显著增加了在攻击区的时间，记录了它们增强的攻击性（图5B）。值得注意的是，DPZ联合治疗后，这种症状明显缓解。综上所述，斑马鱼早期（4-120 hpf）暴露于EHDPP导致的行为毒性可能会延长到成年神经行为阶段，与早期至中期AD中观察到的相同。AD靶向药物DPZ的部分缓解作用提供了令人信服的证据，表明EHDPP可引发诱发神经退行性疾病的巨大风险。

图5。早期暴露于5μg/L EHDPP会导致成年斑马鱼行为异常和脑结构损伤。（A） T迷宫模型和成年斑马鱼在进食区的运动停留时间。（B） 成年斑马鱼在攻击区的镜像攻击和运动停留时间模型。（C） 伊文思蓝染色后斑马鱼脑组织的代表性图像。“正常”表示未染色的正常组织。（D） 斑马鱼脑中伊文思蓝染料的定量检测结果。（E） oclna、tjp1a和cldn15a在脑中的相对表达水平。（F） 成年斑马鱼脑组织的代表性透射电子显微镜图像。（G） 成年斑马鱼大脑中的ATP含量。（H） 成年斑马鱼大脑中Ca2+的相对水平；“*”表示线粒体受损。

细胞内Ca2+超载可导致细胞代谢紊乱，进而损害血脑屏障的完整性。在阿尔茨海默病痴呆、神经变性或脑萎缩发作之前，经常观察到血脑屏障的早期破坏或功能障碍。为了进一步验证EHDPP是否会破坏BBB，在暴露于5μg/L EHDPP后，对成年斑马鱼的BBB损伤和破坏进行了评估，并使用EB染料（一种用于可视化BBB完整性的血浆白蛋白结合示踪剂）进行了定量。与SC组相比，暴露于EHDPP的斑马鱼显示出EB染料在大脑中的附着增加，这暗示了血脑屏障中血浆白蛋白的通透性增加和血脑屏障的严重破坏（图5C，D）。在正常的生理环境中，血脑屏障的稳态和完整性需要众多紧密连接蛋白的联合协作来维持。此后，在转录水平上检查了紧密连接相关基因的表达变化。与SC组相比，在早期发育阶段暴露于EHDPP后，成年斑马鱼oclna和cldn15a的表达受到轻微抑制（图5E）。此外，观察到tjp1a的显著下调（图5E），这构成了导致血脑屏障破坏的危险因素。线粒体在维持AD的核心病理特征中起着核心作用。在亚细胞水平上，脑组织的超微切片证实了细胞器的损伤。透射电镜观察显示，在早期EHDPP暴露组中，斑马鱼脑组织中的线粒体出现扩张、肿胀、破裂、脊柱消融，甚至膜损伤伴液体溢出（图5F）。因此，血脑屏障和线粒体损伤与斑马鱼观察到的异常行为变化相对应。暴露于5-μg/L EHDPP的成年斑马鱼的大脑中持续存在Ca2+水平升高和ATP水平降低（图5G，H），表明EHDPP诱导的阿尔茨海默氏症样症状可能与钙稳态失衡有关，导致线粒体功能障碍和细胞能量降低。

一些污染物应激源是AD进展中的既定危险因素。外源性化学物质的代谢和BBB系统的不成熟增加了胎儿脑损伤的风险。这项研究首次表明，在环境相关浓度下暴露于EHDPP会损害颅内钙稳态，导致细胞内Ca2+超载，破坏Ca2+调节的信号功能，并进一步导致多动行为。值得注意的是，这些毒性效应是持久且不可逆的，从而导致斑马鱼从幼虫到成年的长期行为变化。此外，斑马鱼大脑超微结构的损伤与AD早期至中期的症状相似。这些发现表明，EHDPP在斑马鱼早期暴露会增加成年后AD发展的风险。