第一作者：Lanchao Sun
通讯作者：李传海
通讯单位：青岛大学 公共卫生学院
近日，青岛大学公共卫生学院李传海团队在ES&T上发表了题为Adipogenic Effects of Cresyl Diphenyl Phosphate (Triphenyl Phosphate Alternative) through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Gamma Pathway: A Comprehensive Study Integrating In Vitro, In Vivo, and In Silico from Molecule to Health Risk 的研究性论文。该研究综合了体内、体外和计算机模拟，系统深入地介绍了一种新型苯基磷酸酯替代品CPD和典型苯基磷酸酯TPHP的毒理学影响和健康风险。
甲苯基二苯基磷酸酯（CDP）是一种新型有机磷酸酯（OPE），本研究使用新的替代方法（new alternative methods , NAMs），在分子相互作用、信号通路、细胞功能、动物效应和人群风险方面，研究了CDP和传统OPE磷酸三苯酯（TPHP）的潜在脂肪生成效应和相关风险。鉴于与TPHP的化学结构相似，CDP加上一个甲基，可能通过激活PPARγ诱导与TPHP相似的成脂作用，应及时评估其潜在的成脂风险。此外，应确定CDP是否可以作为TPHP的安全替代品。
在这项研究中，首先使用荧光竞争结合试验筛选了19种常见OPE与PPARγ的结合效力。然后，在HEK293细胞中使用萤光素酶报告基因测定法测定了筛选的化学物质（CDP和TPHP）对PPARγ的转录活性。采用分子对接分析受试化学物质与PPARγ的结合模式。使用3T3-L1前脂肪细胞分化试验，在体外评估了PPARγ介导的脂肪生成作用。通过高效液相色谱和质谱（HPLC-MS/MS）测定其细胞内浓度，使用计算机模拟方法测定HEK293细胞和3T3-L1细胞中的受体结合浓度（RBC）来分析内部生物活性剂量。随后，研究了C57BL/6J雄性小鼠暴露于CDP 12周后体内PPARγ相关的成脂作用。最后，使用基于红细胞剂量度量的定量体外到体内外推（QIVIVE）方法评估了他们潜在的脂肪生成风险。
图1. OPE与人PPARγ-LBD的结合和活性。（A） 荧光竞争结合试验，测试化学物质对人PPARγ-LBD的ROSI的相对结合效力。（B） 荧光竞争结合试验绘制CDP和TPHP与人PPARγ-LBD的竞争结合曲线（C） 荧光素酶报告基因测定在HEK293细胞中CDP和TPHP对人PPARγ的转录活性。（D） 分子对接
在本研究中，我们观察到CDP结合并激活PPARγ，诱导脂肪细胞分化和WAT的形成，表明CDP可能是一种新兴的肥胖源。此外，CDP的致肥潜力比其传统TPHP更强大。在人群中经常检测到的19种OPE中，我们发现CDP是与PPARγ结合最强的化合物，其次是TPHP，这表明它们更有可能触发PPARγ途径。分子对接表明，CDP和TPHP的结构与特异性激动剂SR145非常相似，都含有三个苯环基团，这支持了这些化学物质与PPARγ的有效结合。CDP的模拟结合能和相互作用强于TPHP，这由受体结合和活性测定的结果组成。
图2. CDP和TPHP在3T3-L1细胞中的脂肪生成活性。（A） 3T3-L1细胞经20μM CDP和TPHP处理10天后油红O染色的代表性图像。（B） 油红O染色法比较CDP和TPHP处理的3T3-L1细胞的脂质含量。（C） TG试剂盒法比较CDP和TPHP处理的3T3-L1细胞的TG含量。（D）CDP和TPHP处理的3T3-L1细胞的脂肪生成相关基因mRNA表达。
CDP和TPHP以剂量依赖的方式促进3T3-L1前脂肪细胞的分化。CDP和TPHP促进了脂质积累，脂肪生成相关基因的mRNA表达水平，包括Pparg、脂肪酸结合蛋白4（Fabp4）、脂蛋白脂酶（Lpl）和脂联素（Adip）CDP和TPHP均以剂量依赖的方式增加了脂肪生成相关的基因表达。为了证实PPARγ参与CDP和TPHP诱导的3T3-L1前脂肪细胞脂肪生成作用，引入了特异性PPARγ拮抗剂T0070907。当细胞共同暴露于1μM T0070907时，CDP和TPHP诱导的脂质积累效应和脂肪生成相关基因表达受到显著抑制（图3）。
图3. T0070907对CDP和TPHP诱导的3T3-L1细胞成脂活性的拮抗作用
结果表明CDP和TPHP促进了脂肪生成相关基因mRNA的表达，从而导致3T3-L1细胞分化，这些作用被特异性PPARγ拮抗剂T0070907显著抑制。CDP也表现出比TPHP更高的成脂活性，这与受体结合和活化测定以及分子对接的结果一致。我们的结果还表明，CDP的细胞内量高于TPHP，这表明CDP比TPHP具有更高的跨细胞膜运输到3T3-L1细胞的能力。总体而言，CDP在3T3-L1细胞中的成脂活性明显高于TPHP，这主要归因于其PPARγ结合能力、转录活性和细胞摄取的提高，所有这些都与微小的结构差异有关。
细胞内化学物质的内部浓度是其调节核受体活性和随后细胞反应功效的关键决定因素。对于HEK293细胞，当暴露于3-50μM CDP和TPHP时，细胞内浓度以剂量依赖的方式增加，浓度范围为0.02至1.17 nM/mg pro。
图4图4。HEK293细胞和3T3-L1细胞中CDP和TPHP的内剂量。
基于上述计算机模拟和体外结果，我们发现CDP显示出比TPHP更高的PPARγ结合能力、激动剂活性、细胞脂肪生成作用。在12周的暴露期后，考察了CDP在小鼠中脂肪生成作用。
图5. CDP在小鼠体内的脂肪生成活性。
最终，整合了生物监测数据和通过PPARγ途径的脂肪生成效应的实验证据，以全面评估与暴露于CDP和TPHP相关的脂肪生成的潜在健康风险。为此开发了一种基于生物活性等效剂量（RBC）的QIVIVE方法，该方法弥合了体外实验数据和体内暴露水平之间的差距，通过PPARγ途径更准确地评估CDP和TPHP的脂肪生成风险（图6A）。
图6. CDP和TPHP通过PPARγ途径的脂肪相关健康风险。（A） 基于受体结合浓度（RBC）的CDP和TPHP风险评估工作流程。（B） PPARγ介导的萤光素酶活性的CDP和TPHP暴露范围的分布。（C） PPARγ介导的脂肪生成活性的CDP和TPHP暴露范围的分布。
目前还没有与传统TPHP进行直接比较，以评估CDP是否可以作为更安全的替代品。我们的研究通过PPARγ途径全面研究了CDP的潜在脂肪生成作用和相关健康风险，并将其与TPHP进行了比较，发现CDP可以结合并激活PPARγ，在体外和体内促进脂肪生成活性，并且比TPHP更有效。有趣的是，目前人群中CDP的估计脂肪暴露水平接近我们在0.1mg/kg/天治疗组亚慢性暴露小鼠中检测到的脂肪浓度（3.9ng/g脂肪组织），这表明目前暴露于CDP可能触发了PPARγ途径，可能刺激脂肪形成。因此，考虑到目前人群的暴露水平，与CDP相关的脂肪生成风险似乎与TPHP相似。总的来说，这些发现表明，PPARγ介导的CDP和TPHP的脂肪生成风险应该是一个中度和高度关注的问题。我们认为CDP可能不是TPHP的合适替代品。
随着人类接触CDP的时间增加，CDP的潜在致肥风险将超过TPHP。其潜在的致肥风险应进一步研究，不应被忽视。但没有直接的流行病学证据将CDP和TPHP与肥胖联系起来。在未来的人口研究中，应调查CDP/THP与肥胖之间的关系。有必要进一步研究其潜在的致肥风险，因为证据令人担忧。
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