国自然热点：综合“乳酸化修饰+Warburg效应”的热点文章

2023年12月20日，同济大学医学院/附属东方医院袁健教授课题组在国际顶级学术期刊Cell（当年IF：64.5）上发表“Metabolic regulation of homologous recombination repair by MRE11 lactylation”的研究论文。该研究利用类器官模型、多种动物模型、质谱分析等技术手段多维度探讨了癌细胞中乳酸诱导的MRE11乳酸化导致HR过度激活和化疗耐药。这些发现揭示了细胞代谢与DSB修复以及Warburg效应对化疗耐药的影响的新见解。该研究发现，HR蛋白MRE11在K673位点被CBP乙酰转移酶乳酸化，以响应DNA损伤。MRE11的乳酸化促进其与DNA结合，促进DNA末端切除和HR。在患者来源的异种移植物和类器官模型中，抑制CBP或LDH可下调MRE11的乳酸化，降低HR，并增强肿瘤细胞的化疗敏感性。一种特异性阻断MRE11乳酸化的细胞穿透肽抑制HR并使癌细胞对顺铂和PARPi敏感。

原文链接：https://www.cell.com/cell/abstract/S0092-8674(23)01276-X?_returnURL

首先，作者发现LDHA低表达的患者表现出更高的HR缺乏（HRD），由于LDHA是一种介导乳酸生成的主要酶，且乳酸生成可能反过来促进蛋白质的乳酸化，这说明高水平的乳酸或蛋白质乳酸化可能在HR修复中发挥关键作用(图1A)。于是，通过用乳酸钠（NALA）处理细胞来诱导高度的蛋白质乳酸化，并用HR报告基因法检测变化，发现NALA处理增加了细胞的泛乳酸化、HR修复和辐照（IR）诱导的g-H2AX病灶（与DNA损伤相关）(图1B-E)。接下来，使用LDH抑制剂（LDHi）降低细胞泛乳酸化水平，发现LDHi处理抑制HR修复和强烈的g-H2AX聚焦，表明LDHi损害了DNA损伤修复(图1F-I)。

先前的研究表明，HRD使癌细胞对铂或PARP抑制剂（PARPi）等化学治疗敏感。因此，作者下一步研究乳酸化是否会影响癌细胞对化疗的反应。结果表明，NALA处理导致蛋白质乳酸化增加，导致细胞对顺铂或奥拉帕尼治疗产生耐药性(图1J-L)。相比之下，LDHi治疗降低了蛋白质的乳酸化，使癌细胞对顺铂、奥拉帕尼或依托泊苷敏感(图1M-1P)。此外，LDHA/B的敲低也使癌细胞对奥拉帕尼敏感(图1Q-1R)。综上所述，这些结果表明蛋白质乳酸化可能在DNA损伤修复中起关键作用。

通过对关键HR蛋白的筛选，发现MRE11在细胞中被强烈的乳酸化(图2A)。NALA治疗增强了MRE11的乳酸化，而LDHi治疗则有相反的效果，LDHA/B的消耗再次显著降低了MRE11的乳酸化(图2C)。几种DNA损伤剂也增加了MRE11的乳酸化(图2D)。

接下来重点探究MRE11乳酸化的潜在机制。通过对多个乙酰转移酶的筛选，发现CBP主要介导MRE11的乳酸化，敲低CBP或加入CBP抑制剂（CBPi）显著降低MRE11的乳酸化(图2E-G)。Co-IP实验发现CBP与MRE11存在结合，顺铂处理增加MRE11与CBP的相互作用，体外乳酸化实验进一步证实CBP介导了MRE11乳酸化(图2H-J)。通过质谱分析和位点突变，从四个候选位点(K510、K609、K625和K673)中确定K673为响应DNA损伤的主要MRE11乳酸化位点(图2K-O)。为了进一步确认MRE11的乳酸化位点，使用纯化的GST融合MRE11 WT和K673R突变蛋白进行了体外乳酸化实验。如图2P所示，GST-MRE11 WT在体外被乳酸化，而K673R突变体未被乳酸化。上述研究结果表明K673是响应DNA损伤的主要MRE11乳酸化位点。

MRE11包含两个DNA结合域（DBDs），使其能够同时结合单链DNA（ssDNA）和双链DNA（dsDNA），然而MRE11与DNA结合的机制尚不清楚。在这里，作者首先研究了MRE11的乳酸化是否影响其与DNA的结合。如图3A所示，MRE11乳酸化不影响MRE11、RAD50和NBS1之间复合物的形成。通过体外乳酸化实验和体外DNA结合实验（电泳迁移率变化分析）发现，MRE11的乳酸化促进了MRE11或RAD50-MRE11复合物与dsDNA和overhang DNA的结合（图B-D）。此外，与MRE11 K673R突变体相比，MRE11 WT对DNA的结合亲和力较高（图3E-F）。一方面，NALA处理增强了MRE11和MRE11- K673la病灶形成和MRE11染色质装载，敲低CBP或LDHi治疗显著减少了MRE11病灶形成和染色质募集；另一方面，与MRE11 WT相比，MRE11 K673R在染色质部分中蛋白质保留率和DNA损伤后病灶形成显著减少（图3G-M）。上述研究结果表明，MRE11的乳酸化在DNA结合能力和病灶形成中至关重要。

为了进一步研究乳酸化是否影响DNA末端切除，作者使用NALA或LDHi处理细胞，检测磷酸化RPA2和BrdU焦点的形成。LDHi治疗和敲低LDHA/B均显著降低顺铂诱导的磷酸化RPA2水平，而NALA治疗能够挽救因LDHA/B敲低或LDHi治疗而受损的磷酸化RPA2水平（图4A-B）。这表明乳酸化可能通过CBP-MRE11轴调节DNA末端切除。

NALA治疗显著增加DNA损伤后RPA2、BrdU和RAD51焦点的形成，而LDHi抑制RPA2、BrdU和RAD51焦点的形成（图4C-E）。MRE11 K673R细胞在DNA损伤后磷酸化- RPA2水平降低，而NALA增加了MRE11 WT细胞中磷酸化RPA2水平，但在MRE11 K673R突变细胞中未增加（图4F）。此外，MRE11 K673R突变也损害了DNA损伤后RPA2、BrdU和RAD51焦点的形成（图4G-4I）。作者还使用基于qPCR的DNA切除测量系统进一步证实了MRE11乳酸化在DNA末端切除中的作用（图4J-K）。即与MRE11 WT细胞相比，MRE11 K673R突变细胞显著减少了ssDNA形成。上述研究结果表明，CBP介导的MRE11乳酸化可能对DSBs后的DNA切除至关重要。

由于MRE11的乳酸化增强了DNA切除，这是HR修复的关键步骤，作者接下来测试了MRE11的乳酸化是否调节HR修复和基因组稳定性。如图5A所示，MRE11 K673R突变降低了HR修复，但没有明显影响几个关键DNA修复，特别是DSB修复相关基因的转录表达。此外，通过检测DNA损伤后的γ-H2AX水平和顺铂处理后细胞平均尾矩，确认MRE11 K673R突变损害了DNA损伤修复，作者确定了这一点（图5B-D）。接下来，为了探究MRE11乳酸化是否调节基因组稳定性，作者检测了MRE11 WT和MRE11 K673R细胞中的染色体断裂比例，发现MRE11 K673R细胞在DNA损伤后染色体/染色单体断裂增加（图5E）。

为了确定乳酸化在体内DNA损伤修复中的关键作用，如图5F所示，经IR处理后，LDHi小鼠肺组织中γ-H2AX阳性细胞数量增加。相反，NALA处理显著减少了IR处理后小鼠肺组织中γ-H2AX阳性细胞的数量，并增加了肠绒毛的长度，但这些表型可以被CBPi处理的小鼠逆转（图5G-H）。如图5I-J所示，在LDHA条件性敲除小鼠模型上，NALA治疗可以挽救IR处理后小鼠γ-H2AX阳性细胞数量的增加和绒毛长度的减少。此外，LDHA敲除还明显降低了IR诱导的肺和肠组织中磷酸化RPA2的水平，而这些变化被NALA治疗挽救（图5K-L）。综上所述，这些结果表明NALA或CBPi调控的乳酸化在体内调节DSB修复。

通过分析基底样乳腺癌样本中的HRD评分，作者发现在乳腺癌基因1（BRCA1）高表达的肿瘤中，高LDHA表达与较低的HRD评分相关，这意味着高水平的乳酸或乳酸化可能与BRCA1 WT癌症中的HR增强相关（图6A）。此外，鉴于DNA损伤修复的高效率通常会导致化疗耐药，作者接下来研究了MRE11乳酸化是否会影响癌细胞的化疗反应。如图6B所示，NALA处理导致癌细胞对奥拉帕利产生耐药，而CBPi处理逆转了这一作用。与MRE11 WT细胞相比，MRE11 K673R细胞对奥拉帕利表现出超敏反应，使用CBPi或NALA调节乳酸化会影响MRE11 WT细胞的化疗反应，但对MRE11 K673R突变细胞没有影响（图6C-D）。这些结果表明，在细胞模型中，MRE11乳酸化调节化疗反应。

先前的研究报道结肠癌与Warburg效应高度相关，并产生大量乳酸，可能是结肠癌化疗耐药的主要原因。然而，这些变化背后的机制仍然知之甚少。为了检测MRE11的乳酸化是否影响结肠癌的化疗反应，作者在结肠癌细胞系HCT116和RKO上进行集落形成实验。如图6E-H所示，LDHi和CBPi处理均使癌细胞对顺铂和奥拉帕利敏感，而NALA治疗导致癌细胞对顺铂和奥拉帕尼产生耐药性，且NALA介导的化疗耐药被CBPi治疗逆转。为了进一步证实MRE11乳酸化在化疗反应中的作用，作者使用结肠癌患者源性类器官（PDO）和患者源性异种移植（PDX）模型进行试验。通过检测四种不同结肠癌PDO的MRE11 K673乳酸化水平，将其分为高MRE11 K673乳酸化和低MRE11 K673乳酸化两组（图6I）。结果发现，LDHi和CBPi增强了高乳酸化PDOs（220#、231#）中的顺铂杀伤作用（图6J-K），并且DNA损伤后，在高MRE11 K673乳酸化PDO 220#中，LDHi或CBPi处理显著抑制了磷酸化RPA2水平，在低MRE11 K673乳酸化（223#）的PDOs中，NALA和乳酸治疗均促进顺铂耐药（图6L）。

接下来，作者在3个结肠癌PDX中通过MRE11 K673乳酸化水平筛选得到最高的乳酸化PDX进行体内试验（图6M）。CBPi和LDHi均显著增强了奥拉帕利对高K673乳酸化PDX的杀伤作用（图6N-P）。综上所述，这些结果表明CBPi或LDHi联合治疗可能是治疗高水平MRE11 K673乳酸化癌症的潜在有效策略。

由于靶向CBP或LDH会影响多种信号通路，因此需要一种专门针对MRE11 K673乳酸化的靶向策略。基于蛋白翻译后修饰（PTMs）所涉及的基序，特异性生成的肽已被证明是抑制蛋白PTMs的一种有前途的策略。通过分析MRE11 K673位点附近的序列，合成了5条与CPPs融合的短肽，其中K673-peptide-3#（称为K673-pe）对MRE11乳酸化具有最强的抑制作用（图7A-B）。因此，在K673-pe多肽的基础上，作者合成了一个无序多肽（称为K673R-pe），其中K673残基被一个R残基取代。如图7C、7D所示，K673-pe（而非K673R-pe）显著降低了MRE11的乳酸化，这反过来又降低了顺铂诱导的磷酸化RPA2水平（图7E）。此外，K673-pe在响应DNA损伤时显著抑制MRE11- K673la和RPA2焦点的形成（图7F-H），这意味着K673-pe抑制MRE11 K673乳酸化并导致DNA末端切除显著减少。此外，K673-pe处理还减少了RAD51焦点，这与K673-pe处理细胞中的HR水平急剧降低一致（图7F、7I-J）。这些研究提示肽K673-pe可能通过抑制MRE11的乳酸化而下调HR。接下来研究K673-pe治疗是否能使癌细胞对化疗敏感。如图7K-L所示，K673-pe显著增强了癌细胞对奥拉帕利和顺铂的敏感性，而K673R-pe并未增强。此外，K673-pe使MRE11 WT细胞而非MRE11 K673R细胞对顺铂治疗敏感（图7M），这表明K673-pe通过抑制MRE11乳酸化来调节化疗反应。上述研究结果说明K673-pe靶向MRE11 K673乳酸化可能会增强MRE11 K673乳酸化水平高的癌症的化疗效果。