CRISPR-Cas的出现彻底改变了基因编辑领域。十年来，从Cas9和Cas12等第一代DNA核酸酶的发现，到碱基编辑器、引导编辑器和基因转录激活/抑制编辑器等第二代CRISPR衍生工具的开发，基因编辑领域得到了飞速发展。近年来新发现的小型Cas12和OMEGA家族蛋白，进一步丰富了RNA引导的基因编辑工具箱，并因其递送优势而有很大潜力应用于腺相关病毒（AAV）介导的体内基因治疗。
近日，Science China Life Sciences杂志在线发表了上海脑科学与类脑研究中心、中国科学院上海药物研究所、中国科学院脑科学与智能技术卓越创新中心杨辉研究员和孔祥锋博士的撰写的综述文章“AAV-mediated gene therapies by miniature gene editing tools”，系统梳理了基因编辑工具发展历程，详细阐述了能进行单个AAV递送的小型Cas12和OMEGA效应蛋白，同时，总结并展望了AAV介导的体内外CRISPR基因编辑疗法的进展及未来。
CRISPR-Cas系统通过人工单向导RNA（sgRNA）或crRNA进行编程，使得研究人员能够快速对目标DNA或RNA进行修改，从而革新了基因编辑领域。然而，将CRISPR进行临床应用仍然面临挑战。被广泛应用于基因治疗的AAV载体安全性较高、能转导多种细胞类型，但其载货容量有限（约4.7 kb），不易递送SpCas9等大尺寸编辑工具。非病毒载体如脂质纳米颗粒（LNP）包装容量大，但仅能靶向有限的器官。最近发现的小型Cas12蛋白体和超小型OMEGA核酸酶不仅克服了AAV载体容量限制，并且经工程化改造后提高了编辑效率，因此有很大潜力应用于单个AAV介导的基因疗法开发。
目前常用基因编辑工具的尺寸
与Cas9相比，Cas12家族蛋白种类更加丰富，在尺寸大于1000氨基酸（aa）的Cas12蛋白中，最近新发现的Cas12i蛋白的crRNA长达28bp，可被开发为高保真Cas蛋白。研究人员通过蛋白工程化改造，成功获得了具有更高编辑效率、更特异、PAM更宽的Cas12i突变体——hfCas12Max。在尺寸小于700 aa的小型Cas12蛋白中，Cas12f、Cas12j和 Cas12m均可被单AAV递送，用于DNA编辑；Cas12g则可用于单AAV介导的RNA编辑。由转座元件编码的超小型OMEGA家族的核酸酶IscB（~400 aa）和TnpB（350~550 aa）被认为分别是Cas9和Cas12的祖先蛋白，Fanzor蛋白则是存在于真核生物中的核酸酶，也由TnpB进化而来。通过工程化手段改造核酸酶或wRNA，可以进一步提高IscB、TnpB、和Fanzor等蛋白的编辑效率、特异性、以及TAM范围，使其具有更高的临床转化潜力。
作为最常用的基因治疗载体， AAV病毒递送基因编辑工具主要存在两方面的挑战：一是AAV包装容量有限；二是AAV介导的基因编辑工具的长期表达会增加脱靶风险。虽然可以通过双AAV载体包装大尺寸的SpCas9等编辑工具，但双AAV转导效率低并且会引起病毒剂量限制性毒性风险，因此，小型Cas12和OMEGA家族蛋白及其衍生的基因编辑工具很适合应用于单AAV介导的基因疗法开发。而利用小分子药物诱导调控基因编辑工具的表达，或者将基因编辑工具以mRNA或蛋白的形式进行瞬时表达，均可以降低AAV介导的编辑工具的长时表达可能引起的脱靶风险。目前，针对血液系统疾病的体外基因编辑疗法已有产品（例如，Casgevy）上市；针对眼科疾病、HIV等病毒感染性疾病、以及杜氏肌营养不良症等神经肌肉系统疾病的多种体内AAV基因编辑疗法正处于不同的临床研究阶段。克服DNA尺寸限制瓶颈，并实现基因编辑工具的瞬时表达，对于实现体内AAV介导的基因编辑工具的临床应用至关重要。因此，不断优化递送技术以及开发微型基因编辑系统，将显著扩展体内基因编辑治疗的应用范围。
基因编辑递送技术和体内外基因编辑疗法
总之，该综述论文总结了基因编辑领域的进展，并提出了未来研究的方向，包括发现新的重编程核酸酶系统、基于结构的蛋白质工程化改造、优化递送策略，以及提高计算算法的准确性，通过这些努力，以加速开发针对多种疾病的变革性基因编辑疗法。
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