https://doi.org/10.1186/s43897-024-00109-z
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近日，Molecular Horticulture在线发表了华南农业大学亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室李建国团队的研究性论文，题为LcMPK3 and LcMPK6 positively regulate fruitlet abscission in litchi。该研究首先通过筛选并借助基因沉默体系证实了MAPK激酶级联途径中的LcMPK3和LcMPK6具有促进荔枝落果的功能；通过酵母双杂交筛库，获得了荔枝落果中LcMPK3/6的底物蛋白；通过BiFC, LCI和GST-pull down确证了LcMPK3/6与BR信号转导途径中核心转录因子LcBZR1/2发生蛋白互作；通过phos-tag和LC-MS/MS确定了LcBZR1/2的磷酸化位点。研究结果为阐明MPK3/6调控植物器官脱落的机制提供了重要借鉴。
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背景介绍
生理落果是果树生长过程中常见的现象，这一现象往往对果树的产量和经济价值造成重大损失。荔枝是中国最具特色的热带和亚热带果树，对热区的农民增收和乡村振兴具有重要作用。在荔枝果实发育过程中，多次生理落果高峰（通常3至5次）导致的严重落果是造成荔枝产量低而不稳的关键因素之一。深入理解荔枝果实脱落的调控机制，不仅有助于培育出具有较低落果率的荔枝新品种，同时可为开发荔枝的防落技术提供科学依据。
植物器官脱落是一个受到精细调控的生物学过程。已有的研究表明，拟南芥 MKK4/MKK5-MPK3/MPK6 级联模块参与了许众多生长发育过程，包括花器官的脱落激活。但是，但此信号转导途径在其他植物器官脱落中功能是否保守及其调控机制至今并未见报道。
研究结果
本研究首先对荔枝基因组中MAPK激酶级联途径中的成员进行了鉴定，并通过其在荔枝落果中的转录特征，初步确定了LcMPK3和LcMPK6与荔枝落果相关，并通过病毒介导的基因沉默技术体系（VIGS）对LcMPK3/6调控荔枝落果的功能进行了分析。结果表明，在果柄离区显著下调LcMPK3或LcMPK6的表达水平，降低了与离区细胞壁降解相关基因的转录水平，显著降低了荔枝幼果的累积落果率，说明LcMPK3和LcMPK6共调控荔枝落果，是促进荔枝落果的关键因子（Fig.1）。
Fig.1VIGS介导的LcMPK3或LcMPK6基因沉默降低荔枝落果
注：（a）VIGS沉默后，LcMPK3在果柄离区的表达水平；（b）VIGS沉默后，LcMPK6在果柄离区的表达水平；（c）VIGS沉默LcMPK3/6后，与果柄离区相关的细胞壁降解基因的表达水平；（d）VIGS沉默LcMPK3/6后，幼果的累积落果率。
为了探究LcMPK3/6调控荔枝落果的机制，本研究构建了荔枝果柄离区特异性的酵母杂交文库，通过严格的酵母双杂交筛选，共获得了49个蛋白可能与LcMPK3/6发生蛋白互作，这些蛋白包含5个家族的转录因子（BZR1、NAC72、KNAT3、ZFP、ERF）和2个水通道蛋白（PIP2;5、TIP1;1）（Fig.2）。前期的研究表明，LcBZR1/2是介导BR调控荔枝落果的重要因子（Ma et al., 2021）。因此，本研究对LcMPK3/6和LcBZR1/2之间的互作机制进行了深入研究。首先，通过Y2H、BiFC、LCI及GST-pull down确证了LcMPK3/6与LcBZR1/2发生蛋白互作（Fig.2）。
Fig.2 LcMPK3/6和LcBZR1/2发生蛋白互作
注：（a）Y2H（yeast two hybrid）分析；（b）荧光素酶互补成像技术分析(Luciferase Complementation Imaging, LCI)；（c）双分子荧光互补分析( bimolecular fluorescence complementation, BiFC)；（d）GST-pull down分析。
通过phos-tag揭示了LcMPK3/6可磷酸化LcBZR1/2，随着孵育时间的延长，LcBZR1/2出现了多个凝胶阻滞条带，说明LcBZR1/2存在多个可被LcMPK3/6磷酸化的位点。随后，通过LC-MS/MS质谱分析，确定了LcBZR1存在2个磷酸化位点（S168、S203），LcBZR2存在6个磷酸化位点（S121、S143、S164、S196、S237、S242）（Fig.3）。
Fig.3 phos-tag分析LcMPK3/6磷酸化LcBZR1/2
注：（a）phos-tag分析LcMPK3磷酸化LcBZR1；(b) phos-tag分析LcMPK6磷酸化LcBZR1；（c）phos-tag分析LcMPK3磷酸化LcBZR2；(d) phos-tag分析LcMPK6磷酸化LcBZR2。
综上所述，本研究揭示了LcMPK3/6具有正调控荔枝落果的功能，并通过酵母双杂交筛库获得了荔枝落果中LcMPK3/6的底物蛋白，并通过体内体外实验确证了LcMPK3/6可通过蛋白互作磷酸化修饰转录因子LcBZR1/2。既有的研究表明，转录因子LcBZR1/2可通过转录调控乙烯合成介导BR对荔枝落果的调控（Ma et al., 2021）。在番茄中，TIP水通道蛋白可通过介导离区细胞乙烯合成、ROS稳态和细胞膨压调控花脱落（Wang et al., 2021）。据此，我们推测在荔枝落果中，LcMPK3/6可能通过调控这些信号途径，进而促进荔枝落果。总之，本研究不但为进一步阐明LcMPK3/6调控荔枝落果机制研究指明了方向，也为解析MPK3/6调控器官脱落提供了重要参考。
华南农业大学园艺学院已毕业博士研究生王飞（现任职于天津市农业科学院林业果树研究所）和已毕业硕士研究生梁志俭（现任职于广西壮族自治区农业科学院）为论文的第一作者，华南农业大学园艺学院李建国研究员、赵明磊副研究员为共同通讯作者。该研究得到了广东省粤莞联合基金重点项目（2021B1515120082）和国家自然科学基金项目（32330092 和32072544）的资助。
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