组织特异性mRNA-LNP递送技术的研发策略

mRNA药物的应用主要存在两个关键问题: 

一方面是mRNA分子本身, 其免疫原性能激活一些固有免疫不良反应. 当前这一问题可通过引入非天然核苷酸(如假尿嘧啶、N1-甲基-假尿嘧啶等)进行修饰得到很大改善[1], mRNA修饰技术先驱Katalin Karikó及Drew Weissman教授也因此共享2021年拉斯克临床医学奖。

另一方面是安全和高效递送, 由于mRNA分子量大、携带负电荷且容易被酶降解, 因此需要递送载体的保护以及依靠递送载体协助mRNA进入细胞中进行翻译表达。脂质纳米颗粒(lipid nanoparticle, LNP)递送载体的不断发展为mRNA疫苗的快速获批发挥了极为关键的作用。

事实上, 在整个RNA药物研发历程中, LNP都举足轻重. 2018年, 由Alnylam公司研发的Onpattro获得美国食品药品监督管理局(Food and Drug Administration,FDA)批准用于治疗由遗传性转甲状腺素蛋白淀粉样变性引起的多发性神经病变, 这是历史上第一个小干扰核糖核酸(small interfering RNA, siRNA)疗法, 具有里程碑意义, 其中所用递送载体正是MC3 LNP(D-LinMC3-DMA, 简称MC3); 2020年底, 两款COVID-19mRNA疫苗获得紧急使用授权(此后均已获得正式批准, 商品名称分别为Comirnaty和Spikevax)用于抵抗全球新型冠状病毒感染大流行, 实为历史上mRNA药物的首次问世, 同样依赖LNP递送体系. 这些RNA药物0到1的里程碑事件足以说明, LNP递送载体是推动RNA药物发展的最好选择之一。

经典的脂质纳米颗粒主要由4种类型的脂质分子 组成, 包括可离子化阳离子脂质(关键脂质) 、辅助性磷 脂 、胆固醇和聚乙二醇偶联脂质(图1)[5] .  mRNA-LNP 的制备过程大致如下: 首先, 将mRNA分子溶解在酸性 缓冲液中(如pH  4.0柠檬酸钠溶液);  其次,  将各种脂质 分子按照计算好的比例溶解于乙醇中; 最后, 利用微流 控芯片将水相和乙醇相(3:1,  体积比)快速混合即可完 成mRNA-LNP的制备. 由于水相为酸性环境, 可离子化 阳离子脂质被质子化而带正电荷,  可以通过静电相互 作用与携带负电荷的mRNA分子结合 ,   进而实现对 mRNA的包裹。

随后,  用在pH  7.4的磷酸盐缓冲液透析 处理, 可将体系改变为中性, 促使可离子化阳离子脂质 转变回不带电状态,  此时LNP的表面一般呈现微弱负电状态。一旦该mRNA-LNP进入细胞内涵体/溶酶体(酸 性环境)中, LNP则再次带正电荷, 并随后与生物膜发生 融合促使mRNA释放到胞质中进行高效翻译[6] . 上述这 些特性使得LNP具有安全 、高效递送RNA的能力,  这也是LNP能最终成功的关键因素所在。

目前, RNA-LNP技术已经在肝脏递送(FDA批准的 Onpattro) 、肌肉注射(新型冠状病毒疫苗)相关应用中 取得巨大成功,   这主要得益于肝脏靶向和局部给药 LNP技术的成熟.  为了充分发挥mRNA技术优势,  如低 成本 、高效率 、周期短等,  开发组织靶向LNP至关重 要, 有望加速扩宽mRNA药物的应用场景. 下文将重点介绍领域内的几种研究策略和当前进展,  并在最后进行了适当讨论和展望,  期望该文能够为领域的发展提 供些许有用信息。

如前文所述,  LNP通常由4种脂质成分组成,  这一特性使得LNP制剂相对复杂且具有多样性,  也为研究 多样化LNP提供了简单易行的途径.  静脉注射后,  LNP会在肝脏具有非常明显的富集,  这也使得肝靶向递送 相对容易。

前文提到FDA批准的MC3LNP即为肝脏靶 向递送中最具代表性载体,  对它的研究 非常充分且机制明确。该种LNP进入血液中循环后, 吸附各种不同的血浆蛋白形成“蛋白冠”。

mRNA-LNP的制备以及体外、体内评价示意图

代表性可离子化阳离子脂质、磷脂、胆固醇、聚乙二醇(polyethylene glycol, PEG)偶联脂质和SORT脂质分子的化学结构

其中,  发挥关键作用的是载脂蛋白E(apolipoprotein  E, ApoE), ApoE 与其对应的肝细胞表面受体(低密度脂蛋白受体,  low density lipoprotein receptor, LDLR)结合, 从而实现肝靶向递送。最早获批 的两款mRNA新冠疫苗所使用的SM-102  LNP(Moder- na)和ALC-0315  LNP(Pfizer-BioNTech),  在静脉注射后也主要会在肝脏部位进行mRNA翻译表达。

相比于肝脏递送,  肝外组织靶向递送的研究相对 处于早期. 先前已有研究表明, 优化LNP的配方可很大 程度地提高mRNA的体内外递送功效, 因此科学家 期望通过对肝靶向LNP的配方优化找到一种简单易行 的肝外靶向递送策略 。2020年,   Siegwart教授团队报 道了一种名为“选择性器官靶向LNP递送技术, 实现了精准、简易、通用的 肝外靶向mRNA递送策略。

他们在传统的四组 分肝靶向LNP基础上,  创新性地加入了第五组分(命名 为SORT分子),  制备出五组分LNP体系(代表性SORT分 子的化学结构见图2).   当SORT分子为带正电荷的脂质 时(如DOTAP),  LNP可将mRNA特异递送到肺部表达; 当SORT分子为带负电荷脂质时(如18PA),   LNP则将mRNA特异递送进入脾脏表达;  而SORT分子为可离子 化阳离子脂质分子时(如DODAP),   则LNP会增强 mRNA在肝脏的表达. 值得一提的是, 他们的研究表明, SORT分子的选取不依赖脂质分子的结构 、给药剂 量、检测时间等因素,  只需保证带电性即可;  同时,  这 种策略在5A2-SC8 LNP 、MC3 LNP 、C12-200 LNP中 均实现了快速 、高效的肺 、脾 、肝靶向递送,  具有非常高的普适性。

这一发现为肝外mRNA组织特异性递 送提供了一定的指导原则和解决办法,  领域内多个课 题组运用该技术成功获得并研发出多种多样的组织靶向LNP载体, 进一步证明其普适性。通过靶向肺部 方式递送编码抗原 、抗体或基因编辑工具的mRNA，用于抵抗包括新冠在内的由呼吸道病毒引发的相关病也极具应用前景。

LNP中可离子化阳离子脂质分子最为重要 ,  与 mRNA的包裹效率 、递送效率息息相关,  也是专利申请中最重要的环节之一，因而对它的结构研究也最为丰富。近年来, 一些具有肝外组织靶向性的可离子化阳 离子脂质也在不断地被发现和鉴定出来。Xu教授 团队在该方向做了诸多贡献。2022年, 该团队利用迈克尔加成反应设计合成具有酰胺键结构的可离子化阳离子脂质分子(如306-N16B 、113-N16B),  将它们与磷 脂 、胆固醇和PEG脂质组合制备成N-系列LNP。该LNP可以实现高效的mRNA肺部靶向递送, 其表面蛋白冠成分也与肝靶向LNP有着显著差别,  这一结论与SORT LNP类似, 同样暗示了血清蛋白冠在组织 靶向递送中的关键作用.。

通过筛选、开发新的可离子化阳离子脂质实现mRNA组织特异性递送.

抗体和抗原的特异性识别为研发新型靶向LNP提供了可行性。近些年，运用抗体修饰LNP靶向递送mRNA已经有很多报道。Epstein教授团队在LNP表面修饰了CD5抗体(CD5主要表达在T细胞表面),将编码嵌合抗原受体的mRNA递送至体内循环T细胞并在体内生成原位CAR-T细胞, 可有效治疗心肌纤维化, 恢复心脏正常功能。除了CD5抗体,  其他研究团队还利用了CD3抗体或CD4抗体来修饰LNP, 将mRNA特异性地递送至体内的T淋巴细胞,  实现在体T细胞活化或者重编程改造。

这些重要研究引发国内外研究热潮,  通过mRNA-LNP技术实施原位CAR-T疗法的研究已在产业界取得广泛关注和快速推进.  除T细胞靶向外,  Muzykantov团队在LNP的表面修饰CD31抗体(CD31为内皮细胞表面标志物)实现了肺部靶向性mRNA递送,  并且他们发现这种递送方式是非ApoE依赖的。

最近,  Anderson团队利用CD117抗体修饰LNP, 在体内实现了高效的造血干 细胞和祖细胞mRNA递送以及基因编辑, 为造血干细胞基因疗法提供了新的策略。以上抗体修饰LNP的方法有效实现了肝外器官/细胞mRNA递送，不过大多数 LNP仍旧会在肝脏有较强mRNA表达(脱靶表达),  这也是该技术手段亟待解决的问题之一。

代表性抗体修饰LNP策略以实现器官/细胞的mRNA靶向递送

改变给药方式也是实现组织特异性递送的重要手段之一。如图所示,除静脉注射,还可以使用肌肉注射、皮下注射、吸入制剂等不同方式完成mRNA-LNP的给药。目前获批的新型mRNA疫苗采用肌肉注射方式,该方式下抗原递呈细胞能够快速摄取mRNA-LNP,从而激发特异免疫反应;同样,有报道称皮下给药方式则可能更好实现针对淋巴结系统的靶向递送,有助于mRNA-LNP疫苗的研制。

不同的给药方式对于机体抗LNP抗体的产生也有着较大的影响。此外,针对肺靶向递送,尤其是期望进入气道上皮细胞,雾化吸入、气管内给药则可能是更好的给药途径。Dahlman教授团队此前针对雾化吸入对LNP处方进行了优化,并且在流感病毒模型中证明雾化吸入mRNA-LNP(表达中和抗体)对小鼠具有很好的保护性。不久前,Anderson教授团队筛选了用于气管内给药的可离子化阳离子脂质,能够实现高效率肺部细胞mRNA递送和基因编辑。

代表性mRNA-LNP的局部给药方式和应用场景

近来,Whitehead教授团队研究发现,腹腔注射mRNA-LNP可以将mRNA高效递送至胰腺组织,通过将辅助磷脂替换为带正电的阳离子脂质DOTAP,腹腔注射后mRNA-LNP胰腺递送的特异性有了显著的提高。GauravSahay教授团队利用玻璃体内注射修饰有感光细胞靶向多肽的LNP实现了针对眼部的mRNA递送。上述这些给药方式的选择,为器官靶向递送mRNA-LNP提供了另一途径,尤其是针对表层组织器官的转染。

综上所述,  研发组织靶向mRNA-LNP技术具有重大的科学意义和经济价值。 运用多种LNP研发策略 、 配合mRNA序列研发 、结合先进的人工智能技术,  相信会有更多新型靶向技术涌现而出。