开发新型LNP，增强mRNA内体逃逸能力，提高mRNA疫苗效果

接种疫苗是预防带状疱疹和PHN的唯一有效手段。受基于mRNA技术的新冠疫苗推动，由Moderna或辉瑞/BioNTech开发的基于mRNA的带状疱疹疫苗都已进入临床试验。目前，唯一获得临床批准的mRNA递送系统是脂质纳米颗粒（LNP），它由可电离脂质、辅助磷脂、胆固醇和聚乙二醇（PEG）脂质组成。然而，由于LNPs逃逸细胞内体的能力有限，将mRNA释放到细胞质中的效率受到影响。因此，开发具有改进的内体逃逸能力的新型LNP制剂可以提高mRNA疫苗的有效性。

2023年12月25日，中国科学院化学研究所吕雪光团队、大连理工大学林佳奇团队、中国中医科学院崔晓兰团队及近邻生物在 Advanced Materials 期刊发表了题为：A Synergistic Lipid Nanoparticle Encapsulating Mrna Shingles Vaccine Induces Potent Immune Responses and Protects Guinea Pigs from Viral Challenges 的研究论文。

该研究开发了一种复合型LNP配方，通过将一种具有高内体逃逸能力的额外可电离脂质加入传统的LNP四组分配方中，构建了具有更好内体破坏能力的复合型LNP（Syn-LNP），在体内和体外实验中均表现出更强的mRNA表达。

基于这一新型Syn-LNP递送系统，研究团队开发了封装编码VZV糖蛋白E（gE）mRNA的带状疱疹疫苗——mgE@Syn-LNP，其诱导的细胞和体液免疫应答显著高于用临床批准的可电离脂质（Dlin-MC3-DMA）配制的对照LNP，且在豚鼠的攻毒实验中表现出良好的耐受性和有效性。

Syn-LNP最适配比

研究人员首先制备了一种传统四组分LNP，由cKK-E12作为可电离脂质，其余组分采用DSPC、胆固醇和DMG-PEG2k。在此基础上，引入了具有高度膜破坏能力的可电离脂质L319，其疏水尾链与亲水头部的相对大小都高于cKK-E12（图1A），体积较大的疏水尾链可以使L319具有更好的膜破坏能力。

通过将不同摩尔比的L319与cKK-E12结合，并以各自单独制备的L319-LNP和cKK-E12-LNP作为对照，封装编码荧光素酶mRNA（mLuc）以检测两种可电离脂质的最佳比例。结果显示，与单独使用cKK-E12-LNP相比，cKK-E12与L319的摩尔比为6：4或8：2的Syn-LNPs的mRNA表达进一步增强，表明同时使用cKK-E12和L319作为可电离脂质具有协同作用（图1C）。Syn-LNP的mRNA封装效率在cKK-E12-LNP和L319-LNP之间（图1D）。

此外，研究人员进一步评估了Syn-LNP在37°C下保存一周的胶体稳定性。Syn-LNP在储存过程中的水动力直径和PDI保持不变，表明其具有良好的胶体稳定性。

图1. Syn-LNP的结构和表征

膜破坏能力验证

研究人员使用与红细胞共孵育的方式验证不同配方的膜破坏能力，红细胞的溶血程度与LNPs的膜破坏能力呈正相关。在pH值为7.4时，由于可电离脂质没有被质子化，所有的LNPs都未表现出溶血能力。在pH值为5.5时，Syn-LNP的溶血能力低于L319-LNP，但高于cKK-E12-LNP（图1G）。说明与cKK-E12-LNP相比，Syn-LNP中L319的掺入有助于增强其膜破坏能力。

除溶血试验外，研究人员还使用基于荧光共振能量转移（FRET）的试验来进一步评估LNPs的融合能力（图1H）。当LNPs与模型内体脂质体融合后，NBD的荧光信号会由于猝灭量的减少而增加。如图1I所示，Syn-LNP的融合能力高于cKK-E12-LNP，但低于L319-LNP。

这些结果表明，L319的掺入有助于提高Syn-LNP的膜破坏能力，从而提高其内体逃逸能力和最终的mRNA递送效果。

小鼠模型验证

研究人员通过肌肉注射将LNPs-mLuc给药C57BL/6小鼠，并以MC3制备的LNPs作为对照。如图2所示，Syn-LNP在注射部位的mRNA表达量最高，约比MC3-LNP高2.3倍，比cKK-E12-LNP高4.1倍，比L319-LNP高2.5倍。这些结果表明，在cKK-E12-LNP中加入L319显著提高了其在体内的mRNA的表达。

图2. Syn-LNP的体内模型效力验证

在此基础上，研究人员还使用Syn-LNP包封卵清蛋白（OVA）mRNA作为模型抗原研究Syn-LNP递送mRNA疫苗的潜力。如图2C显示，与PBS和MC3-LNP处理组相比，mOVA@Syn-LNP显著增加了引流淋巴结中CD11c+、CD80+和CD11c+、CD86+细胞的数量。在脾脏的树突状细胞（DC）中也观察到类似的结果（图2D）。这些结果表明，mOVA@Syn-LNP在体内可有效激活DC。

mRNA抗原设计

除了高效的递送系统，mRNA抗原设计也决定了最终的免疫反应。有研究报道，减少VZV gE蛋白上的O-糖基化位点可以增强其与IgG抗体的结合，从而有可能提高免疫识别和应答。然而，本研究发现，某些N/O-糖基化位点的缺失可能会影响gE蛋白的折叠或表达，从而导致免疫反应的降低。小鼠实验发现，去除VZV gE糖基化显著降低了其产生gE特异性抗体的免疫原性。因此，研究团队选择了编码全长VZV gE蛋白的mgE进行后续研究。

体液免疫反应

研究人员为比较mgE@Syn-LNP的mRNA疫苗与FDA批准的VZV疫苗的疗效，另外两组小鼠在相同的给药方案下，分别接受了VZV减毒活疫苗Zostavax（L-VZV）或AS-01佐剂的VZV gE亚单位蛋白疫苗Shingrix（S-VZV），并额外纳入了一个接受MC3-LNP封装mgE的对照组小鼠。

使用ELISA法分析总VZV gE特异性IgG抗体反应。如图3B-D所示，L-VZV的总IgG、IgG1、IgG2a水平均低于其他组，免疫效果不理想。而mgE@Syn-LNP的总IgG、IgG1和IgG2a滴度仅略低于S-VZV，而高于mgE@MC3-LNP。这些结果表明，mgE@Syn- LNP激活了类似S-VZV的混合Th1/Th2反应。mgE@Syn-LNP的IgG1/IgG2a比例最低，表明mgE@Syn-LNP更倾向于偏向Th1的反应，这对细胞免疫很重要。

图3. mgE@Syn-LNP在C57BL/6小鼠中的体液/细胞免疫验证

细胞免疫反应

后续实验中，研究人员通过分离免疫小鼠的脾细胞，并用gE肽体外刺激来评估mgE@Syn-LNP的细胞免疫反应，采用IFN-γ酶联免疫吸附点（ELISpot）法检测gE特异性T细胞反应。如图3F和3G所示，mgE@Syn-LNP和S-VZV均诱导了强大的gE特异性T细胞反应，分泌IFN-γ。相比之下，MC3-LNP和L-VZV疫苗产生的T细胞应答明显低于mgE@Syn-LNP诱导的T细胞应答。与mgE@MC3-LNP相比，mgE@Syn-LNP的细胞免疫反应更强，这可能是归因于复合型LNP提高了mRNA递送效率。

此外，使用ELISA分析了再刺激后脾细胞培养物上清液中的细胞因子。mgE@Syn-LNP产生了最高水平的IL-2和IFN-γ，这两者都是Th1细胞相关的细胞因子（图3H和3I）。流式细胞术显示，mgE@Syn-LNP在所有组中产生的IFN-γ+、CD4+、CD3+、CD45+ T细胞数量最多（图3J）。总的来说，这些数据表明，mgE@Syn-LNP诱导了强大的细胞免疫反应。

Syn-LNP激活广泛强烈而持久的免疫反应

为验证Syn-LNP的泛用性，研究还在BALB/c小鼠中进行了对应前阶段的对照实验，并采用ELISA法检测总IgG、IgG1、IgG2a、IgG2c滴度。结果显示，mgE@Syn-LNP在初免后第6周诱导的gE特异性总IgG滴度比MC3-LNP、S-VZV和L-VZV分别高约2.0、1.8和26.0倍，IgG1抗体滴度也显示类似的趋势，证明mgE@Syn-LNP诱导了更高水平的体液免疫反应，在促进Th1型反应上具有相当的效果（图4B-D）。

此外，与S-VZV相比，mgE@Syn-LNP诱导BALB/c小鼠的IgG滴度较高，而在C57BL/6小鼠内诱导的IgG滴度较低，这表明不同小鼠模型对这些疫苗表现出不同的免疫应答。令人惊讶的是，mgE@Syn-LNP在8个月内表现出持续的高水平总IgG反应，这表明mgE@Syn-LNP可以提供持久的保护。

在细胞免疫方面，与PBS治疗相比，S-VZV和mgE@Syn-LNP产生了更高的CD3+、CD8+、CD44+、CD62L-low效应记忆T细胞（TEM）和CD3+、CD8+、CD44+、CD62L-high中央记忆T细胞（TCM）群体。

总的来说，这些结果与在C57BL/6小鼠中的研究一致，并表明mgE@Syn-LNP在不同种系小鼠中都触发了广泛强烈的体液和细胞免疫反应。这种有效和持久的免疫反应可以通过促进受感染细胞的清除和限制病毒复制来增强对VZV感染的保护。

图4.  mgE@Syn-LNP在BALB/c小鼠中的免疫反应

在豚鼠模型实验中，接种mgE@Syn-LNP完全可以保护豚鼠避免出现皮疹，表明引起了强烈的免疫反应，从而中和了VZV。mgE@Syn-LNP在保护豚鼠免受活VZV的病毒挑战方面与S-VZV一样有效。

图5.  mgE@Syn-LNP有效保护豚鼠免受活VZV病毒的感染

Syn-LNP毒性研究

为探究Syn-LNP的潜在毒性，研究人员每周两次监测所有免疫的C57BL/6小鼠、BALB/c小鼠和豚鼠的体重。研究发现，mgE@MC3-LNP或mgE@Syn-LNP处理的小鼠在加强注射后表现出轻微的体重减轻，但很快恢复到正常体重，没有观察到接种过疫苗的豚鼠的体重减轻。C57BL/6小鼠主要器官组织切片包括心、肺、肾、脾、肝、脑、肌肉、注射部位的苏木精和伊红（H&E）染色，形态无明显变化。这些数据表明，mgE@Syn-LNP在体内没有明显的毒性。

该研究通过在传统的四组分LNP中添加一种具有高度膜破坏能力的额外可电离脂质L319，大大增强了mRNA在体内外的递送，超过了MC3-LNP的递送效果。基于该递送系统设计的VZV mRNA疫苗在小鼠/豚鼠种得到了与GSK的Shingrix相当的免疫刺激能力，并优于减毒活VZV疫苗。因此，Syn-LNP包封编码VZV gE蛋白的mRNA疫苗可能是一种很有前途的带状疱疹候选疫苗。