mRNA递送系统的制约因素与成功经验

然而，RNA疗法由于RNA分子量较大，携带阴离子电荷，容易被人体RNA酶降解，让这些分子难于进入细胞中行使它们的功能。就像重组蛋白疫苗需要佐剂加持一样，mRNA疫苗的发展同样受到递送系统的限制。可以说，有效的递送系统是mRNA疫苗成功的一半。研究人员一直在努力克服在临床治疗中有效利用RNA疗法的主要递送挑战，包括靶向递送，内体逃逸，以及重复给药的安全性问题。

不仅如此，在优化mRNA疫苗制剂本身外，生产工艺优化、生产放大以及工业生产中的质量控制是研发mRNA疫苗过程中同样不可忽视的重要领域，决定着mRNA药物最终能否成功进入临床使用。

本文将部分总结已有研究对克服上述问题所做出的努力，帮助认识目前mRNA制剂递送系统研究与生产中需要克服的关键问题。

与常规药物相比，mRNA递送系统的设计概念与众不同。mRNA递送载体本身需要克服细胞外和细胞内双重屏障，保护血液中核酸酶活性的同时增强和协助细胞摄取，并在进入细胞后促进内体逃逸。

目前已进入研究或上市的mRNA纳米载体普遍存在以下问题：

器官、细胞特异性靶向，特别是肝外靶向。

所有非病毒递送载体都容易在肝脏富集并清除。这很大程度上是由于肝窦促进纳米颗粒的外渗和清除，以及纳米颗粒表面冠层和肝脏细胞之间的相互作用。

肝窦可以被看成是一种毛细血管，直径只有不到15个微米，而其中的血液流速不到动脉的0.001倍，这导致血液中的纳米粒子在肝窦内的停留时间较长，并且更容易接触到肝窦内的细胞。

此外，肝脏是典型的内皮网状系统(RES)的器官，Kupffer细胞和肝窦内皮细胞(LSECs)都具有摄取纳米粒子的能力，尤其是Kupffer细胞，可以通过吞噬作用，大胞饮作用，内吞作用等多种方式内化纳米粒子，此外肝窦内皮细胞是疏松多孔没有基底膜的内皮细胞，纳米粒子可以通过他们表面的孔除或者是他们之间的间进入到Disse空间以及肝实质区域而在肝脏积累，最终通过肝胆系统排泄到体外。

因此，肝脏清除是阻碍纳米药物临床转化的主要障碍之一

有效功能性递送，需要药物克服细胞外和细胞内双重屏障进入细胞质发挥作用。

纳米颗粒的内体-溶酶体逃逸效率是影响核酸递送载体递送效率的限制性因素。许多药物，特别是大分子药物如核酸或蛋白质，不能直接穿越细胞膜。因此，它们通过受体介导的内吞被摄取到细胞内，并被囊化在内体中。如果药物不能及时从内体中逃逸，内体可能会与溶酶体融合。溶酶体含有能够分解许多生物分子的酶，这可能导致药物被降解，从而失去其治疗效果。即使某些药物能够从内体中逃逸，其逃逸效率也可能不高，这意味着只有一小部分药物能够到达其细胞内的目标位置。以递送效率相对较高的LNP为例，被细胞吞噬的LNP仅有1-2%可成功实现溶酶体逃逸。因此，需要针对药物递送中出现的生物屏障对纳米颗粒进行定制设计。

安全性，以及重复给药后安全性和耐受性的维持

安全性是药物研发中需要首要考虑的，出于人用疫苗安全性和耐受性方面的考虑，递送载体不仅需要关注药物本身引起的机体免疫原性，也要考虑重复给药后的整体影响。

以LNP为例，虽然其安全性较病毒载体更好，但研究表明，重复给药后仍可能诱导机体炎症反应。尽管该炎症性质会产生所谓“自佐剂效应”，增强适应性免疫反应，但仍需关注高剂量下引起强烈炎症并由此导致的组织损伤等严重副作用。

制剂体外稳定性

纳米颗粒体外稳定性主要分为物理稳定性和化学稳定性，制约了制剂的可及性和有效性。当前mRNA-LNP疫苗的一个缺点是必须在超低温下储存，对疫苗在全球运输、储存和流通是个极大的挑战，而大多数其他疫苗则可以在2-8°C下储存。

不同mRNA制剂的物理不稳定性主要来源于包封mRNA的泄漏，这主要影响制剂的整体稳定性。值得注意的是，LNP的包封率通常> 90%，并且尚未报道过在储存期间出现mRNA泄露的情况。 然而，LNP在储存和流通过程中容易发生 LNP的聚集，所以为了增加稳定性，LNP 中通常添加PEG化脂质，可防止LNP聚集。

生产放大及质量控制

CDE撰写发布了纳米药物3大指导原则：《纳米药物质量控制研究技术指导原则（试行）》《纳米药物非临床安全性研究技术指导原则（试行）》和《纳米药物非临床药代动力学研究技术指导原则（试行）》。

从目前已公布的资料中，我们也能发现一些在CMC阶段中共性的问题，特别是在原辅料、生产用设备机构等等，这些问题在不少药企的研究阶段都会面临，因此需要格外注意。纳米药物的质量控制重点关注纳米药物的质量性质对安全有效性的影响。

基于风险评估的质量控制研究可包括以下几方面：

1）纳米药物的类型、组成和结构；

2）纳米药物最终贮存形式、给药途径和方式、治疗目的等；

3）纳米药物表征方法的准确性和适用性；

4）纳米药物制备工艺可控性，包括中间控制、控制策略的耐用性等，对产品关键质量属性的影响；

5）纳米药物的质量性能对药品贮存和使用过程中的稳定性、药物的体内释放、药物及其载体的药代动力学、体内分布、生物学效应、安全性以及作用机制的影响。

对纳米药物的关键质量属性进行重点研究和充分表征，不仅有利于纳米药物制备工艺参数的优化和关键质量属性的确定，为全面质量控制和药品质量标准的建立提供依据，也有利于探究纳米药物的生物学特性和作用机理等，提高纳米药物体内行为的可预测性，为临床前和临床研究提供参考。

Dahlman等人在题为“Drug delivery systems for RNA therapeutics”的综述文章中根据FDA已经批准的RNA药物递送系统，总结了成功递送系统均具备的六大主要特征：

1. 具有灵活的可扩展性（如在可电离脂质中引入酯键修饰改善LNP安全性），并可以被生物降解。

2. 化学合成途径足够简单，能够生产放大以支持在人类中使用的生产规模。

3. 递送系统需要有可以接受的靶向和脱靶比率。靶向和脱靶需要同时使用生物分布和功能化指标来衡量。因为95%的RNA可能被保留在内体（endosome）中无法逃逸，生物分布并不见得能够预测RNA的有效功能性递送。

4. 产生疗效的RNA剂量必须显著低于可能产生毒性的剂量。理想情况下，毒理研究应该在非人灵长类动物中进行。

5. 药物制剂的活性能在不同生产批次间保持一致。

6. 在大多数临床环境下，重复给药不会导致疗效或安全性的丧失。

适合在临床环境下使用的递送系统的特征

特异性靶向

实现mRNA药物的特异性靶向分为主动靶向和被动靶向两种策略。

主动靶向被许多人认为是药物递送的圣杯。mRNA药物的主动靶向涉及通过用从小分子配体到单克隆抗体的靶向部分修饰纳米颗粒的表面来递送到特定的细胞类型。

来自浙江大学的申有青教授团队开发了一类酯酶响应性季铵盐类脂质提高脾靶向LNP稳定性和mRNA转染效力。该LNP在生理条件下携带正电荷，但在酯酶存在下迅速转变为负电荷，从而在储存和体内递送期间稳定包封mRNA，同时保证细胞质中mRNA的有效释放。

来自河南大学-澳大利亚麦考瑞大学生物医学联合创新中心（JCBI）的师冰洋教授团队设计了一种新型mRNA纳米药物ABNPs@mRNA。该研究采用了红细胞膜伪装的仿生纳米颗粒平台，选择性地将mRNA通过血脑屏障递送入大脑，以靶向GBM

美国德克萨斯大学西南医学中心Daniel J. Siegwart教授课题组报道了一种器官选择性靶向（SORT）技术，对纳米粒子进行系统设计，在LNP中添加了第五种脂质分子（阳离子DOTAP），用来调节内部电荷，用于递送mRNA和CRISPR/Cas基因编辑到小鼠的肺、脾和肝脏内。

除了开发具有主动靶向能力的递送载体，还可以通过不同给药途径或内源性预测进行组织特异性被动靶向。

耶鲁大学、霍华德休斯医学研究所开发一种可吸入、局部给药的输送载体，能够将治疗性mRNA输送到肺部，并以此开发了一种针对新冠病毒的mRNA黏膜疫苗。研究人员利用末端基团修饰和聚乙二醇优化了可生物降解的聚（胺共酯）(PACE)多肽用于mRNA的递送。

通常静脉注射纳米颗粒会吸附血清蛋白，在全身给药后积聚在肝脏中。通过准确预测血清蛋白吸附在纳米颗粒上形成的蛋白冠以及该过程如何影响纳米颗粒的生物分布可实现mRNA药物的被动靶向。

中国药科大学张文丽副教授团队研究发现，一方面可以采用PEG修饰、两性离子涂层（如磺基三甲铵乙内酯及聚一甲基丙烯酰氧基乙基磷酰胆碱等）及生物膜涂层包裹纳米粒，减弱蛋白冠的形成；另一方面，可对纳米粒进行修饰，使其在体内吸附特定的蛋白质（如聚磷酸酯的修饰有利于纳米粒吸附载脂蛋白A-I及载脂蛋白J）或在体外预包裹特定的蛋白质（如白蛋白，转铁蛋白及乳铁蛋白等）作为人工蛋白冠（Artificial protein corona），提高其对不同组织的靶向效率。

内体逃逸

纳米颗粒实现溶酶体逃逸机制其一是质子海绵效应，质子海绵效应通常是PEI，PAMAM等阳离子高分子材料的溶酶体逃逸机制。质子海绵效应是指阳离子聚合物在溶酶体内发生质子化，质子不断被泵入内体/溶酶体。为了保持电解质平衡，氯离子也大量泵入内体/溶酶体。这导致内体/溶酶体渗透压变高，最终导致内体/溶酶体破裂，释放聚合物载体。

纳米颗粒实现溶酶体逃逸的第二种机制是膜融合，脂质材料可通过脂质-内涵体膜融合实现内体-溶酶体逃逸的常见递送载体。脂质与内体-溶酶体膜融合后可导致内体-溶酶体膜不稳定，使脂质材料从内体-溶酶体的孔洞中逃逸，从而提高核酸递送效率

以LNP为例，LNP中的可电离脂质在pH 7.4时接近中性，而内化进入细胞后，在pH较低的内涵体内逐渐质子化，并与内涵体的阴离子内源性磷脂结合破坏其双层结构。该过程需要可电离脂质的尾部横截面大于其头基的锥形形态，使得可电离的脂质/内涵体磷脂离子对与双层结构不相容，更可能形成倒六角形相等结构破坏内体膜。这一效应也被称为分子形状假说。

来自挪威的生物制药公司PCI Biotech开发了一种用于递送mRNA分子的fimaNAc技术通过其创新的光化学内化（PCI）技术平台可增强mRNA药物在治疗皮肤相关疾病时的内体逃逸能力。当药物被内吞进入内体时，利用光敏分子Fimaporfin(TPCS2a)便可以通过光控激活，诱导光引发的内体释放。另外，不同的波长还将导致不同的组织渗透。

来自美国埃默里大学生物医学工程的James E. Dahlman副教授团队通过对脂质纳米颗粒组分的立体化学进行研究，发现含有立体20α-羟基胆固醇（20α）的LNPs向肝细胞传递mRNA的能力是含有20α-和20β-羟基胆固醇混合物（20mix）的LNPs的3倍，纳米颗粒的立体构象能显著影响载体的内体逃逸能力。

安全性及耐受性

一般来说，药物的重复给药安全性和耐受性除了药物本身的设计外，还跟剂量有关。然而，要达到药物起效的必要剂量，提高mRNA药物的转染效率是降低剂量相关毒性的有效手段，而该方法不外乎提高纳米载体的靶向性和内体逃逸能力。

此外，研究载体本身适应不同靶向器官时引起的不同免疫反应也值得关注。例如，LNP介导了肌肉注射部位和引流淋巴结中的细胞因子生成，引起注射部位红斑和水肿等不良反应。已报道PEG脂质带来的例如超敏反应、血液清除加速，以及重复给药引起的PEG抗体相关全身免疫原性。目前已开发了多种PEG替代脂质以提高纳米载体的安全性和有效性，包括聚甘油/poly(glycerol), 聚恶唑啉/poly(oxazolines), 和聚氨基酸/poly(amino acid)s等。

制剂稳定性

提高mRNA制剂体外稳定性的方法包括配方策略，例如添加缓冲液、表面活性剂和其他赋形剂，使用有效的过程控制，以及使用适当的冷冻保护剂（蔗糖、海藻糖或甘露醇）冷冻或冻干。尽管已知该过程会影响纳米颗粒的大小和封装，但这些属性不是影响载体性能的唯一决定因素。

来自瑞吉生物的科研团队开发了一种精确温控及更低水分残留优化的冻干技术，可以满足mRNA-LNP在室温下的长期储存需求并能维持复溶后的转染效力。mRNA-LNP经过冻干后热稳定性显著提高，且可以保持其理化性质及生物活性。预计该方法可以延长mRNA-LNP疫苗在2-8℃的保存时间。

来自比利时根特大学药学院的研究团队在开发了一种连续冻干技术的基础上进一步筛选了不同缓冲液类型和脂质配比对冻干制剂存储稳定性和复溶后转染效力的影响。当可电离脂质：mRNA wt比足够高并且使用Tris或磷酸盐而不是PBS作为缓冲液时，mRNA LNP的性质在冷冻干燥后能保持不变。

生产放大及质量控制

在研究阶段用于制备LNP的过程与用于临床和商业生产的工艺之间存在重大差异，这最终会影响其性能。为了确保在放大生产的制造过程中保持产品的关键质量属性，控制工艺参数并确定相应的质量标准非常重要。

彻底了解如何混合脂质和 RNA，以稳健和可重复的方式制备纳米颗粒是成功制备和递送 LNP 的关键。流速、温度和混合比等关键工艺参数 (CPP) 会影响所得纳米颗粒的物理化学特性。需要适当的分析和生物测定来评估工艺变量的变化如何影响纳米颗粒的性质，包括粒径、多分散系数 (PDI) 和药物包封率 (EE%)，以确认在所有开发阶段均保持了产品特性、效力和安全性，从而指导配方和工艺开发。

微流控混合平台在过去几年中越来越受欢迎，主要由于四个重要方面：

（1）流速和混合条件的高度可控性，可以制备均匀的（单分散）LNPs，减少批次间差异;

（2）便于工业水平的生产放大和提高生产率的能力;

（3）实时监测微通道内发生的生产情况;

（4）具有定制微通道几何形状和结构的微流体装置，用于增强LNPs的载药量和复合物稳定性。

目前有以下几种工业生产常用的方式：

1. T型或Y型混合器

T型或Y型混合器是微流控装置最早和最基本的设计之一。在T型液混合方法中，含有核酸的水相溶液与含有脂质有机溶剂的乙醇溶液在T型连接器中使用双泵系统混合（图2）。由于混合方法快速，脂质分子过饱和，允许LNP自组装成所需的结构，而无需考虑额外减小尺寸的方法。最后经过滤可以进一步稳定颗粒。尽管与传统方法相比，该方法表现出许多优点，但仍存在一些挑战。

2. 流体动力流聚焦混合（Hydrodynamic flow focusing）

实现不同类型LNP连续生产的最广泛方法之一是流体动力流聚焦混合。在这种方法中，含有脂质的有机溶液通过中央入口通道，而核酸水相溶液从两个侧入口通道注入。这两种流的混合物发生在一个小区域内，这允许在受控的层流条件下产生液滴。

与传统T型或Y型微流控通道类似，该方法也可以通过修改中央通道的直径和微通道设计以调整混合时间。

3. 交错人字形和环形混合器

通过利用连接到微流控装置的交错人字形结构，可以进一步改进制备过程。开发这种方法是为了改善对混合过程的控制并减少混合时间。有机溶液中的脂质和水溶液中的核酸被泵入两个单独的入口。然后，交错的人字形结构引起混沌平流的混合层流，由于流体之间接触面积呈指数级增长，使得两种溶液能快速有效地混合（图2）。然而，对于商业规模目的，人字形设计具有局限性，因为很难达到良好生产规范（GMP）所需的高通量速度（流速容量）。

图2. 代表性微流控装置的原理图示

可以说，mRNA疗法正在逐渐改变制药领域的格局。mRNA疫苗具有简化疫苗发现和开发的潜力，同时具有快速开发能力、多功能性、有效性、安全性、可扩展生产和成本效益的突出特性。也因此，人们不断展望未来利用和扩大mRNA疫苗来应对各种疾病，为解决未有有效治疗手段疾病的预防和治疗提供可能性。

mRNA疗法临床转化的关键之一在于递送系统及制剂的CMC环节，生产安全、高效、特异性、可放大和可监控递送载体制剂的需求日益增长，不仅需要与时俱进的专业生产人员，也离不开符合各项标准并不断完善的专业生产设备。