下呼吸道感染是全球主要健康问题之一，每年至少导致300万人死亡。先前的研究发现健康人与患者的下呼吸道微生物群落存在显著差异，这提示微生物组在免疫稳态中起到关键作用，且可能是新的治疗目标。
但是在进行相关研究时，实验过程中面临诸多的挑战，例如高丰度的宿主DNA污染问题、微生物生物量相对较低的情况，以及连续收集下呼吸道样本所面临的困难，导致目前我们对下呼吸道感染微生物组的认识十分有限。
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2024年9月27日，浙江大学蒋超课题组联合北京大学第三医院冷玉鑫课题组和中南大学湘雅二医院罗红课题组，在Nature Communications杂志在线发表题为“Deep longitudinal lower respiratory tract microbiome profiling reveals genome-resolved functional and evolutionary dynamics in critical illness”的研究论文。该研究通过开发新型的低生物量微生物富集方法（Chelex100-based low-biomass microbial-enrichment method， CMEM），成功实现了对ICU患者下呼吸道微生物组的深度宏基因组分析，揭示了微生物群落的动态变化、医院特异性病原体和抗性基因组的分布，为重症感染的精准诊断和个性化治疗提供了新思路。
蒋超课题组主要围绕暴露组和微生物组在各类自然和人体环境的多样性、功能、进化动态、环境互作展开多学科交叉的前沿研究。
团队开发的CMEM技术是本文的一大亮点，这是一种基于Chelex100的低生物量微生物富集方法，该方法专为从低微生物质量样本中提取和富集微生物DNA而开发，这种方法特别适用于下呼吸道（LRT）样本，因为这些样本通常受到宿主DNA的污染，且微生物质量较低，从而给传统的微生物分析方法带来挑战。
图1 实验流程的示意图
宿主DNA耗竭步骤中，加入了含有皂苷的PBS溶液孵育。皂苷则作为一种裂解剂，用于破坏宿主细胞膜，释放微生物，从而在提取微生物DNA前减少宿主DNA的污染。
DNA 提取中加入了Chelex 100树脂进行DNA提取，这是一种吸附微量DNA的方法，常用于法医学中。
这篇文章的研究思路是首先开发一种新的基于Chelex100的低生物量微生物富集方法（CMEM），用于从ICU患者的LRT样本中提取和富集微生物DNA。然后应用宏基因组对这些样本进行深度测序，通过MEGAHIT进行宏基因组组装，CheckM评估基因组质量，并使用MaxBin和MetaWRAP进行基因组分箱。接着，利用GTDB-Tk进行物种分类，Prodigal和KofamKOALA进行基因识别和注释，ARG-OAP和CARD数据库分析抗性基因。此外，研究还结合流行病学数据，通过inStrain等工具分析可能的菌株传播事件，并使用Gubbins等工具进行进化分析和重组热点检测，最终揭示了ICU患者LRT微生物组的物种多样性、抗性基因分布、菌株特异性的抗性组和毒力组，以及微生物群落的进化动态。
1、CMEM在下呼吸道微生物组深度测序中的应用
作者通过对比处理和未处理的样本，发现CMEM处理对微生物群落的整体beta多样性无显著影响（图1c，d），且微生物群落的alpha多样性和ARGs总丰度在两组间也无差异。在157名患者的下呼吸道中共监测到了196个细菌，2个真菌以及6个病毒。其中25个机会性病原菌在所有的医院中都被检测到，包括klebsiella pneuomniae, Acinetobacter baumannii, 以及Pseudomonas aeruginosa.(图1b)。这些结果表明CMEM是一个有效的工具，适用于低生物量和高宿主核酸污染的临床样本中LRT微生物群落的表征。
图1 ICU患者下呼吸道微生物组研究概览
2、ICU 患者 LRT 微生物群的特征
作者通过CMEM对中国三个不同城市医院的157名插管患者收集的453个LRT样本进行了宏基因组测序，成功测序了442个样本，平均每个样本获得7.09×10^7个高质量reads（图1a）。排除了与ICU环境和医疗设备污染相关的物种，从而全面表征了危重病患者LRT中的微生物群落，共鉴定出204种微生物，包括196种细菌、2种真菌和6种病毒（图1b）。研究发现，肺炎患者的微生物群落α多样性显著低于非肺炎患者，且肺炎患者样本中的ARGs总丰度显著更高。通过从头组装和个体水平的分箱，获得了433个宏基因组组装基因组（MAGs），其中120个基于MIMAG标准的高质量MAGs（图1d）。这些MAGs被划分为四大门类，包括Proteobacteria、Actinobacteria、Firmicutes和Bacteroidetes。
3、肺炎患者下呼吸道微生物组显示出显著的地点特异性特征
通过变异分解分析（图1e）发现，采样地点是影响肺炎患者下呼吸道微生物组谱型变异的主要因素，抗生素种类和ICU住院时长也有一定影响。PCoA分析（图2a，b）揭示了不同医院间微生物谱型的异质性，Adonis测试显示显著差异（p = 0.001）。具体来说，医院A中肺炎克雷伯菌丰度较高，医院B中纹带棒状杆菌丰度较高，而医院C中鲍曼不动杆菌更为常见。这些结果表明，不同医院的特定微生物因素对患者LRT微生物组谱型有显著影响。
图2 肺炎患者的下呼吸道微生物群落显示出显著的部位特异性特征
4、LRT 微生物组的时间动态
作者对在ICU住院超过一周病诊断为肺炎进行LRT微生物组的跟踪探究，发现一些患者在插管期间其优势菌种保持不变，如P68患者中铜绿假单胞菌始终为优势菌（图2c），而另一些患者的优势菌种随时间变化，例如P23患者从鲍曼不动杆菌变为普氏菌（图2d）。
5、临床变量与下呼吸道微生物抗性基因组相关性分析
作者通过深度测序数据详细描述了肺炎患者下呼吸道抗性基因组，发现多重耐药、β-内酰胺类和氨基糖苷类抗生素抗性基因在患者中最丰富（图2e）。这里主要使用了非度量多维尺度分析（NMDS）和多变量线性混合模型来分析抗性基因与临床变量之间的关联（图2f-j），结果显示，肺炎患者样本中特定抗生素抗性基因的丰度显著更高，且在ICU住院超过28天的患者中，多重耐药基因的丰度增加，这可能与ICU住院时间延长有关。
6、菌株水平的抗性基因组和毒力的变化
作者进一步分析了五种主要机会性病原体的91个高质量MAGs，发现鲍曼不动杆菌、肺炎克雷伯菌和铜绿假单胞菌的ARGs数量显著高于纹带棒状杆菌和普氏菌（图3a），而ARGs谱在不同菌种间几乎没有重叠（图3b）。在菌种内部，特别是鲍曼不动杆菌、纹带棒状杆菌和肺炎克雷伯菌，也观察到显著的抗性差异（图3c）。铜绿假单胞菌携带大量VFs，而纹带棒状杆菌和普氏菌的VFs数量较少（图3d）。ARGs和VFs数量呈强正相关，表明高度抗药性菌株更具有致病性（图3e）。VFs的分布也显示出菌株特异性（图3f）。
图3 菌株水平分析展示重症监护病房中优势菌种的抗生素耐药基因和毒力基因的功能图谱
7、常见机会致病菌中可移动基因元件和高度保守的质粒的分析
作者利用MobileElementFinder对移动遗传元素（MGEs）进行分类，并发现它们与ARG密切相关（图4a, b）。较为普遍的机会性病原体种类拥有更多的MGEs，且这些MGEs的长度分布存在显著差异（图4c）。与MGEs相关的ARGs主要提供对氨基糖苷类、大环内酯类和头孢菌素类抗生素的抗性（图4d）。此外，通过深度测序数据，使用Plasmid Database (PLSDB)直接鉴定了68种质粒，这些质粒在不同菌株中显示出高度保守性，例如从鲍曼不动杆菌中分离的质粒在长达40年的时间跨度内ANI高达99.992%（图4f, g）。这些发现强调了MGEs在病原体传播抗性基因中的作用，以及质粒在细菌适应性中的长期稳定性。
图4 下呼吸道微生物组中的可移动元件组和超保守质粒
8、下呼吸道机会性病原体中SNP和重组热点的识别
进一步通过分析高通量测序数据和MAGs，探究了下呼吸道机会性病原体的进化。结果发现，在鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌中存在SNP密集区域，这些区域与遗传多样性升高相关（图5a, b）。特别是在鲍曼不动杆菌中，识别出三个SNP密集区域，并计算出全基因组的核苷酸多样性，揭示了这些区域的遗传多样性（图5c）。这些SNP密集区域被认为是细菌进化中重组的热点（图5c, d）。相比之下，肺炎克雷伯菌的重组热点与SNP热点并不完全对应，暗示该菌种可能通过突变等非重组机制获得SNPs（图5b）。这些发现有助于我们理解这些病原体的进化动态和遗传变异的分布。
图5 鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌菌株中频繁重组区域的进化和功能分析
9、重组热点的功能性影响
作者随后分析了细菌重组热点对基因功能的影响，发现这些热点区域的基因与细菌的生存和环境适应性密切相关。在鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌的SNP密集区域中，观察到与关键代谢途径、细菌共轭、毒素-抗毒素系统以及重组相关的基因（图5e）。特别是在鲍曼不动杆菌中，发现了与IV型分泌系统相关的virB5基因，以及与II型毒素-抗毒素系统相关的ParE毒素基因。在肺炎克雷伯菌中，则发现了一个完整的原噬菌体区域，这些基因编码噬菌体附着蛋白（图5f）。这些结果表明，重组热点区域的基因在细菌对临床环境的适应中起着重要作用。
10、全基因组比较揭示了单个病房内以及病房之间可能发生的菌株传播事件
作者通过全基因组SNP比较和纵向采样，发现了三个中心内鲍曼不动杆菌和肺炎克雷伯菌的12个潜在菌株传播事件（图6a）。利用从下呼吸道样本直接恢复的高质量MAGs，作者对这些传播事件进行了基因组层面的分析，并通过对相应样本的体外培养分离物进行ANI验证，确认了其中8个事件。这些事件中菌株间的ANI极高（99.9995%至100%），SNPs差异极少（0-16个）。对10名患者的纵向采样数据显示，至少5名患者在ICU入院时未检测到相关物种，而在后续采样中被鉴定出来，支持了潜在传播事件的可能性。研究结果表明，ICU患者可能从其他患者或环境微生物库中获得病原体，强调了系统调查微生物传播和环境微生物组对于评估临床环境生物医学安全的重要性。
图6 菌株水平分析展示重症监护病房中频繁发生的潜在菌株传播事件
研究团队开发了一种高效的微生物富集实验流程，无需培养即可对下呼吸道样本进行深度测序并直接重建高质量的MAGs，从而实现进一步复杂的分析。
在这项研究中，团队系统地分析了中国三家医院ICU病房内157名患者的453个下呼吸道分泌物样本，深入探究了重症监护病房患者下呼吸道微生物群落的动态变化、耐药基因组以及基于菌株水平的基因组功能、传播及进化特征。该研究不仅为下呼吸道微生物组研究提供了新的有力工具，也为深入理解重症监护病房患者下呼吸道微生态环境、优化临床诊断和治疗策略提供了重要的理论依据和数据支持。更多详情还请大家移步原文，仔细品鉴。
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参考文献：
[1] Cheng, M., Xu, Y., Cui, X. et al. Deep longitudinal lower respiratory tract microbiome profiling reveals genome-resolved functional and evolutionary dynamics in critical illness. Nat Commun 15, 8361 (2024). https://doi.org/10.1038/s41467-024-52713-8
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