单核细胞是诱导特异性免疫应答的关键免疫细胞，对颅内动脉瘤(IAs)的进展、预后和免疫治疗具有重要影响。因此小编和大家分享一篇今年6月刚刚发表在Front Immunol (IF:5.7/Q1)杂志上基于单核及巨噬细胞( Mo/Ma)构建IAs诊断模型的文章，该研究也探索了Mo/Ma与IAs发病机制和免疫微环境的相关性。
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一．文章摘要
文章的主要流程如图1所示。具体来说研究首先从GEO数据库获取IAs的单细胞测序(scRNA-seq)数据。接着研究基于单细胞数据和高维加权基因共表达网络分析(hdWGCNA)识别出IAs的单核细胞亚群。此外，研究也整合六种机器学习算法识别了与Mo/Ma相关的四个关键基因。随后，研究开发了一个多层感知器(MLP)神经模型用于诊断IAs。研究也进一步采用CIBERSORT和MCP方法分析单核细胞特征与免疫细胞浸润和患者异质性的相关性。最后研究也通过实时荧光定量PCR和免疫组织化学对结果进行了验证。
二．文章的主要内容及结果
1.IAs细胞亚群的识别及异质性分析
研究进一步分析了单核细胞亚群，结果发现IAs中并非所有单核细胞都普遍上调，只有簇0显著上调(图3A，B)。研究接着利用miloR工具量化了组间所有细胞丰度的变化(图3C，D)。结果观察到IA_Monocyte和Pericyte之间、VSMC和成纤维细胞之间以及other_Monocyte和DC细胞之间的相互作用频率和强度均较高(图3E)。研究也观察到IA_Mono和Other_Mono表现出增强的输出和输入交互强度(图3F)。此外，也观察到IA_Monocyte向其他细胞发送和接收更多的信号是由INF-1介导的，而Other_Monocyte向其他细胞发送更多的信号是由IGE介导的，接收更多的信号是由CX3C介导的(图3G)。接下来研究分析并比较了各种细胞类型表现出更强相互作用的具体通路(图3H)，结果发现与Other_Mono相比，成纤维细胞在SPP1相关通路中向IA_Mono发送了更强的信号，而在CCL相关通路中IA_Mono比Other_Mono发送了更强的信号。
图3 IAs中Mo/Ma亚群比例的改变
2.HdWGCNA识别与Mo/Ma相关的关键基因
研究接着识别了Mo/Ma的关键基因。研究首先基于hdWGCNA利用单细胞数据构建了共表达网络(图4A)，识别了9个基因模块(图4B)。其中图4C显示了这9个模块的前10个关键基因。研究观察到在基因模块内以黄色和棕色表示的基因分别在亚群0和1中表达更高(图4D)。此外，蓝色模块与红色模块表现出强正相关，粉色模块与黄色和棕色模块表现出强正相关，绿松石模块与品红模块表现出强正相关(图4E)。接着研究对每个模块中的前25个核心基因进行评分(图4F)。
图4 hdWGCNA揭示了IAs发病机制中的关键Mo/Ma基因
3.细胞轨迹和功能富集分析
4.Hub基因的表达分析
研究接着分析了hub基因的表达。研究识别的100个hub基因表达相关性如图6A所示，接着通过STRING数据库对100个基因进行了PPI分析，并将蛋白质相互作用的结果可视化和映射，结果发现23个基因具有很强的生物学功能相似性(图6B)。接下来，研究绘制了柱状图和火山图，展示hub基因的表达(图6C，D)。
5.通过机器学习识别和验证关键基因
研究接着通过机器学习识别了关键基因。首先研究根据机器学习算法进一步筛选最有诊断价值的关键基因，通过LASSO分析共识别出8个基因(图7)。研究接着整合五种机器学习算法，分别为RF、SVM-RFE、NNET、Boruta和KNN(图7B-F)，识别了4个共享的关键基因，分别为LGMN, FN1, SRGN和CXCL16(图7H)。其中图7G展示了RF算法在中相对重要的前50个基因。
6.评估关键基因的表达及诊断意义
7.构建预偏多层感知器神经网络模型
文章接着基于关键基因构建了IAs的神经网络诊断模型。研究首先对卷积神经网络进行了200次训练(图9A)。通过将这些选定的特征输入与初始权重相结合，使得输出层四个簇中的一个可以很容易地分类(图9B)。研究发现4个关键基因在IAs样本和对照样本中的表达存在显著差异，通过这4个基因可以区分IAs样本和对照样本，研究也在在训练组中观察到模型准确率为70%，在验证组中的准确率为100%(图9C，D和F，G)。接着研究通过单因素Cox回归模型筛选出1467个特征，作为构建MLP神经网络节点的输入，结果观察到模型在两个数据集中都表现出了很好的预测精度(图9E, H)。
8.关键基因与免疫特征的相关性分析
文章接着分析了关键基因与免疫特征的相关性。研究首先通过MCP-counter分析了4个关键基因与免疫细胞的关联，结果观察到单核细胞与CXCL16和LGMN高度相关(图10A)。进一步研究根据免疫检查点和免疫细胞浸润表达进行免疫特性评估(图10B)，结果发现IRF8信号转导通路与4个关键基因高度相关，MAF信号转导通路与CXCL16、LGMN、SRGN高度相关。此外，研究计算了IAs样本和免疫细胞之间的相关性，观察到大多数检测的位点在IAs患者中显著上调(图10C，D)。最后，研究通过热图比较了实验组和对照组与免疫通路之间的关系(图10E)。
9.验证4个模型相关基因的表达
文章最后对模型的4个关键基因的表达进行了验证。研究采用RT-qPCR检测了10例IAs顶叶组织和10例颞浅动脉中相关基因的表达水平，结果发现LGMN, FN1, SRGN和CXCL16的表达在IAs中上调(图11A-D)。免疫组化分析也观察到IAs组织和对照组织中LGMN、FN1、SRGN和CXCL16表达与邻近正常组织相比显著升高(图11E-H)。
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