谷氨酰胺（Gln）代谢对于维持干细胞的存活、增殖、特异性和分化至关重要。由此，营养环境中的外源性谷氨酰胺被认为间接参与细胞生命过程和干细胞定向调节，如癌症干细胞的氧化还原平衡和表观遗传学修饰。本次实验旨在利用全自动氨基酸分析系统和柱后检测来评估在DMEM培养基中氨基酸的长期降解情况。
试验方法
实验使用英国品牌Biochrom 的Bio 30+氨基酸分析仪分析各种细胞培养基的氨基酸浓度。简单来说，培养基样品使用离子交换液相色谱法（IEX）进行检测，并用柠檬酸锂缓冲液按照1:1稀释。HP高效锂系统程序分别取0,14,33,68和96天的细胞培养基样品进行检测，注射体积为20μL（样品和标准品均为20μL），并通过使用添加了色氨酸（Trp）和谷氨酰胺的钠水解缓冲液校准数据。进行实验的细胞培养基分别是：DMEM (D6046, Sigma-Aldrich; SA) ，DMEM (11885084, ThermoFisher; TF), DMEM high-glucose (D6429, Sigma-Aldrich; HG), DMEM F-12 Ham (D8437, Sigma-Aldrich; HAM), 以及 DMEM GlutaMAX (10567014, ThermoFisher; GM)。所有的培养基均以4摄氏度保存。数据通过Biochrom自制的Pheonix软件获取，随后使用OpenLab软件进行数据分析。
Phoenix Software
Biochrom Bio 30+氨基酸分析仪实验流程示意图；系统包括控制单元（仪器左侧）、自动取样器（仪器右侧）和Phoenix软件。每个样品的制备时间约为1分钟。系统自动运行每个样品的时间约为130分钟（且系统可过夜运行），样品之间有43分钟的自动pH重置步骤。此离子交换色谱法（IEX）可在检测时不受样品介质中无机盐、糖、维生素或其他添加剂的干扰
试验结果
下图为每种试验培养基样品中的氨基酸浓度（mg/L）。数据以第0天和第14天相应培养基中每种氨基酸检测浓度的平均值±标准差（SD）表示。谷氨酰胺检测中显示的高值标准差SD表明样品降解。#是指DMEM-GM培养基中存在的丙氨酸Ala-谷氨酰胺Gln的校准浓度值。
下图为谷氨酰胺在时间流逝下的降解情况。图为DMEM-SA培养基在第0天和第96天的锂色谱图。下方的标准色谱图显示出了各类氨基酸峰的标记。牛磺酸（Tau）和缬氨酸（Val）用作内部对照，氨（Amm）用作证实氨基酸分解的标志物。在实验期间，谷氨酰胺的检测浓度显著降低，谷氨酰胺峰的曲线下面积（AUC）降低了20%。同时，氨的浓度增加，氨峰的曲线下面积上升了35%，表明谷氨酰胺正在降解。
下图为谷氨酰胺降解的表征。图A：第0天（细胞培养基到达后一天）检测的氨基酸浓度与制造商数据表的偏差。这些点代表氨基酸的各个数据点（谷氨酰胺代表橙色，其他氨基酸代表蓝色）。水平线表示平均值，虚线表示标准偏差SD。*代表与制造商数据表相比，p < 0.05，统计方式是Tukey事后检验的单因素方差分析。图B：在实验期间，谷氨酰胺的检测浓度显著降低（降低了26%）。数据符合指数衰减函数，并估算出了谷氨酰胺在DMEM-SA培养基中的半衰期（53.37±16.73天）。右上角的图表显示了第14天时对比DMEM-GM培养基中存在的丙氨酸Ala-谷氨酰胺Gln，所有细胞培养基中谷氨酰胺相对降解的情况。
自动化的离子交换色谱法（IEX）免受检测样品介质产生的数据干扰。下图为第0天（蓝色）和第14天（橙色）测试介质（不包含DMEM-GM培养基）的平均锂色谱图。彩色线表示所有色谱图的平均值，阴影表示相关的标准差。色谱图的高相关性（第0天r=0.94±0.05，第14天r=0.98±0.01）表明Biochome Bio30+的离子交换色谱法技术不受检测介质中无机盐、糖、维生素或其他添加剂的干扰。右上角的四个图表明了从第0天到第14天检测介质中谷氨酰胺的降解。下方的标准色谱图显示出了各类氨基酸峰的标记。牛磺酸（Tau）和缬氨酸（Val）用作内部对照，氨（Amm）用作证实氨基酸分解的标志物。
结论
氨基酸分析仪（Biochrom Bio 30+）是一款准确、自动化的系统，可用于检测各类细胞培养基中氨基酸的浓度。
由于营养环境中的谷氨酰胺降解程度会随着时间增加，此现象限制了细胞培养基的长期使用。因此，在纵贯研究中，应注意始终使用较为新鲜的细胞培养基。
Biochrom Bio30+氨基酸分析仪
该仪器采用金标准方法，并能提供准确的组成分析，给您在研发和制造阶段带来更值得信赖的结果。
特点
· 通过氨基酸组成分析识别活性生物制药成分
· 通过分析动物和人体的生理液体（如血浆或尿液），评估试验结果和新配方
· 在治疗产品中，包括复杂基质，进行氨基酸总量或单个氨基酸的定量
· 检测异常氨基酸并确认合成或重组蛋白
·定位“游离”氨基酸并识别杂质
