华南理工大学王辉课题组 Adv Mater. 和Nano Lett.连续发文

具有自噬诱导功能的聚吡啶盐材料联合递送抗氧化酶治疗动脉粥样硬化

动脉粥样硬化是一种慢性血管疾病，主要是由血液中的脂质、炎症细胞和纤维组织在动脉壁的积累形成的。其中，动脉部位的单核细胞在炎症环境中被诱导为巨噬细胞，识别并吞噬血液中过量的氧化低密度脂蛋白（oxLDL）。当oxLDL在胞内积累后，巨噬细胞将进一步转化为泡沫细胞，并产生更多的自由基和炎症因子，进而招募更多的免疫细胞。凋亡的泡沫细胞在动脉内壁的不断积累，形成不稳定斑块，最终导致动脉粥样硬化。近年来，大量证据表明，诱导细胞自噬对动脉粥样硬化治疗具有积极的影响。首先，自噬可以促进细胞内脂滴的降解和清除过程，抑制泡沫细胞的形成。其次，自噬可以通过减少促炎因子的释放来发挥抵抗炎症的作用，有助于控制动脉粥样硬化相关的炎症反应。此外，动脉粥样硬化是一种慢性炎症疾病，活性氧（ROS）水平与动脉粥样硬化的发展和进程密切相关。基于其特殊的病理微环境，将自噬诱导和ROS抑制结合起来，有望为动脉粥样硬化的治疗提供新的可能。

近日，华南理工大学王辉课题组联合华东师范大学程义云团队和上海交通大学第一人民医院王长平团队设计了一系列具有细胞自噬诱导功能的聚吡啶盐高分子递送载体，同时递送两种抗氧化酶（SOD和CAT），通过促进巨噬细胞的自噬能力以及降低细胞内的ROS水平，达到了对动脉粥样硬化的治疗作用。上述工作以“Polypyridiniums with Inherent Autophagy-Inducing Activity for Atherosclerosis Treatment by Intracellularly Co-Delivering Two Antioxidant Enzymes”为题，发表在Advanced Materials上。论文第一作者为华南理工大学前沿软物质学院博士研究生梁梦晓和上海交通大学第九人民医院王谦。

 图1.  具有自噬诱导活性的P5c联合递送SOD和CAT治疗动脉粥样硬化

作者通过比较不同碳链长度和修饰比例的聚吡啶盐高分子库对蛋白质的递送能力，从结构与功能的关系上，揭示了聚吡啶盐高分子通过静电、疏水和cation-π相互作用与蛋白质结合形成稳定的蛋白质复合物，并筛选出蛋白递送效率最高的P5c（碳链长度为5，季胺化比例为70%）为主材料进行后续研究。通过肝素钠（heparin）、Tween-20以及10%血清的竞争释放实验表明，P5c主要通过疏水相互作用稳定结合蛋白质，并且具有一定的抗血清性能。

图2.  聚吡啶盐高分子材料的蛋白质胞内递送能力筛选

随后，作者又进一步研究了P5c递送蛋白质的入胞过程，通过对细胞内吞通路进行抑制以及与早期内涵体和溶酶体的共定位分析，发现P5c/eGFP不仅通过巨胞饮和脂筏作用等能量依赖方式进入细胞，还存在非能量依赖的入胞方式。接着钙黄绿素的泄露和入胞实验结合巨型单层囊泡（GUVs）的内含物泄露实验，表明了该非能量依赖方式为膜打孔。

图3. P5c递送蛋白质入胞的机理

在充分研究了P5c递送蛋白质的性能和机理后，作者利用P5c联合递送SOD和CAT进入巨噬细胞。结果表明，该策略可以成功的将两种抗氧化酶递送进巨噬细胞内，并且降低LPS刺激的炎症型巨噬细胞内的ROS水平，并能有效调节巨噬细胞的极化以及炎症因子的分泌。

图4. P5c将SOD和CAT递送到巨噬细胞中以清除细胞内ROS并调节巨噬细胞极化

随后，作者详细的验证了P5c以及P5c/S/C复合物对细胞的自噬诱导能力。作者构建了稳定表达mCherry-GFP-LC3B蛋白的143B细胞系，通过对LC3B蛋白的招募情况进行表征，表明了P5c具有诱导细胞自噬的功能。接着，作者对泡沫细胞内的脂滴情况以及LC3和p62等自噬相关蛋白的表达情况进行了检测，结果表明，P5c和 P5c/S/C复合物可以通过激活泡沫细胞的自噬水平，促进泡沫细胞对脂滴的降解，减缓泡沫细胞的生成。

图5. P5c及P5c/S/C复合物通过诱导细胞自噬以抑制泡沫细胞的形成

最后，作者利用中性粒细胞膜对P5c/S/C复合物进行包被，实现复合物对动脉炎症环境的靶向作用。在AopE^-/-动脉粥样硬化小鼠模型中，NeuM@P5c/S/C展现出优异的治疗效果。对小鼠动脉部位的切片分析结果表明，该纳米材料不仅能够显著清除斑块部位的ROS水平，还能有效激活该部位细胞的自噬水平，从而抑制动脉粥样硬化的发展。

图6. NeuM@P5c/S/C在治疗动脉粥样硬化方面显示出优异的治疗效果

淀粉样变新材料多方面治疗阿尔兹海默症

阿尔茨海默病（AD）是一种逐渐进展的神经退行性疾病，与大脑中的异常蛋白质沉积（特别是β-淀粉样蛋白，简称Aβ斑块）以及金属离子（如铜、锌等）的失衡有着密切的关联。这些异常变化导致大脑神经元功能受损，进而引发记忆力减退、认知功能下降、行为异常等一系列症状。目前，阿尔茨海默病的治疗难度较大，主要依靠药物、非药物治疗及生活方式调整等综合手段来缓解症状、延缓病情进展。然而，由于早期诊断困难、社会认知不足以及治疗方法有限等因素，该疾病的治疗现状仍然面临诸多挑战。

针对AD治疗中存在的挑战，特别是与大脑中异常蛋白质沉积（Aβ斑块）及金属离子失衡相关的问题，华南理工大学王辉课题组与华东师范大学程义云教授团队创新性地开发了一种基于8-羟基喹啉（8-HQ）的聚合物DHQ。该聚合物旨在通过递送一种关键的抗氧化酶——超氧化物歧化酶（SOD），来有效对抗Aβ聚集介导的神经毒性，从而减缓AD的病情进展。DHQ展现出了卓越的蛋白质递送能力，它能够高效地将SOD精准地递送到目标细胞内。作为出色的蛋白质递送载体，DHQ在递送过程中不仅确保了货物蛋白的稳定性和完整性，还避免了对其生物功能的任何损伤。实验结果表明，当DHQ成功将SOD递送入细胞后，细胞内的活性氧（ROS）水平显著降低，这有助于减轻氧化应激，保护神经元细胞免受Aβ聚集介导的损害。

图1. DHQ对蛋白GFP以及抗氧化酶SOD的胞内递送。

此外，该聚合物在纳摩尔浓度下能有效抑制三种与纤维化相关的蛋白质的纤维化：β-乳球蛋白（BLG）、胰岛素和Aβ1-40。其中着重研究了DHQ对Aβ1-40肽纤维化的影响（图2）。结果表明金属离子加速了纤维化过程，但无论金属离子是否存在，DHQ都阻止了Aβ的纤维化进程，保持了Aβ的球形形态。进一步地，DHQ在浓度低至40 nM时即可有效抑制胰岛素纤维化。圆二色性（CD）分析表明，在高温孵育后，胰岛素的二级结构被破坏并变性，而在相同条件下，加入DHQ后胰岛素的二级结构得以保持。这些结果共同表明，DHQ可以有效抑制蛋白质的纤维化过程。

图2. DHQ 对 Aβ1-40 和胰岛素淀粉样变性的抑制作用。

PC12细胞可分化为神经元样细胞，且对各种神经毒性物质敏感且易受损，便于研究阿尔茨海默病（AD）的病理过程。我们将5% RBITC标记与非标记Aβ1-40混合制备可视化纤维聚集体，可从图3看出，DHQ组中未出现明显红色纤维聚集体。Aβ沉积可触发细胞产生ROS，损害细胞正常生理功能并诱导凋亡。图3表明，Aβ1-40增加了PC12细胞内ROS水平，而DHQ或SOD处理均能降低ROS水平，且DHQ/SOD复合物效率最高，其ROS水平与正常生长细胞组相当。

图3. DHQ/SOD 对 PC12 细胞 Aβ 淀粉样变性抑制作用的体外研究。

鉴于Aβ、ROS和细胞毒性关系密切，DHQ递送SOD有望协同增强淀粉样相关疾病的治疗效果，为治疗与淀粉样变性相关的疾病提供了一种多方面的策略。

以上成果近期以“A Hydroxyquinoline Polymer with Excellent Amyloidosis Inhibition and Protein Delivery Ability to Combat Amyloid-β-Mediated Neurotoxicity” 为题发表在《Nano Letters》上。文章第一作者为华南理工大学前沿软物质学院博士生陈乐，通讯作者为华南理工大学王辉副教授以及华东师范大学程义云教授。

图文：前沿软物质学院

编辑：余锦婷

初审：王辉

复审：康德飞

终审：王林格