导读
正文
然而，FTO具有高度的细胞环境复杂性，其在不同细胞、组织中的表达水平以及亚细胞定位差异较大，并且不同环境刺激会导致FTO的亚细胞定位发生动态变化，影响着FTO的功能发挥，导致体外实验无法完全模拟在细胞环境中FTO的真实状态。因此，亟需开发一种新型探针，在活细胞和活体层面对FTO进行动态、准确的成像分析。
近日，中山大学的戴宗/潘逸航/许宇智团队首次提出了一种计算机辅助筛选的、去甲基化可变构的适配体探针设计（DSA-m6A sensor），实现了m6A去甲基化酶FTO的单细胞、3D肿瘤球和活体层面的无延时成像分析以及抑制剂筛选。该设计由m6A修饰的适配体序列（Aptamer）、与适配体部分互补的封闭模块（Blocker）以及基于poly-T的连接模块（Linker）三个模块组成，两端分别标记荧光基团与淬灭基团形成分子信标结构。该设计将“分子识别”、“相互作用”和“信号输出”三个部分高度集成到单个DNA分子开关中，形成通用型并且可定制的成像平台。
作为概念验证，以“能量通货”三磷酸腺苷（ATP）的适配体序列作为构建DSA-m6A的Aptamer模块。特异性位点的m6A修饰可高效抑制ATP适配体的活性，首先利用计算机辅助方式对潜在的m6A修饰位点进行高效筛选，模拟结果表明，ATP适配体的A10位点的m6A甲基化会导致ATP结合结构域的错误折叠并削弱分子间作用力，从而导致适配体的结合活性显著降低。根据计算机筛选结果构建DSA-m6A10传感器，与无m6A修饰的wt-DSA相比，DSA-m6A10与ATP配体的结合能力下降约90%。随后通过FTO介导的去甲基化作用，恢复原有的结合活性，实现将近10倍的荧光信号恢复。该传感器由FTO激活后可以被0.5 mmol/L ATP（细胞内ATP浓度为0.5 − 5 mmol/L）在1.64秒内快速驱动，有望实现无延时的FTO酶活性分析。
该传感器被应用于FTO的体外灵敏检测和FTO抑制剂的高效筛选。其简单的“一锅法”步骤有望实现高通量的抑制剂筛选。此外，该传感器还成功地应用于单一细胞内完整的FTO核质异位过程的动态示踪，提供了单个细胞里FTO的时空分布信息，有助于研究FTO空间调控的分子基础。进一步利用微流控液滴技术构建了仿生异质型的3D细胞球模型，该模型由高侵袭性的乳腺癌细胞与正常乳腺细胞在GelMA水凝胶中混合形成。成像结果表明，该传感器的荧光信号在3D细胞球模型中与癌细胞高度定位，能够清晰区分癌细胞与正常细胞。最后，该传感器被应用于乳腺癌MCF-7皮下荷瘤小鼠的FTO酶活性成像，实现首例FTO酶活性的活体成像研究。
与以往所报道的荧光RNA适配体或金属离子驱动的DNAzyme、CRISPR系统相比，以“能量通货”ATP驱动的DSA-m6A10具有以下优点：（1）Lag-free无延时的传感过程，其快速的动力学响应能够在活细胞、活体中实时、准确示踪FTO的动态变化；（2）Self-sufficient 自给自足型传感器，无须额外添加外源物质，不会改变微环境，能够呈现FTO的自然状态；（3）Highly-integrated高度集成化的模块设计，理论上适用于任何DNA适配体和任一能够抑制适配体活性的表观修饰。这种简单而通用的传感策略将为RNA去甲基化的基础研究、临床诊断、药物开发等提供一个有应用前景的工具，同时也为发展活体内其他表观遗传关键酶的动态成像分析提供新颖性的思路和通用的平台。
这一成果近期发表在Journal of the American Chemical Society上，并申请中国发明专利一项。文章的通讯作者为中山大学生物医学工程学院戴宗教授以及中山大学附属第七医院的潘逸航教授、许宇智助理研究员，第一作者为中山大学生物医学工程学院博士研究生施亚坤。研究成果得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金、广东省传感技术与生物医疗仪器重点实验室、深圳市医学研究专项资金、深圳市科技计划项目及广东省自然科学基金等项目资金的支持。
