一氧化氮（NO）作为一种重要的气体信号分子，在心血管、免疫和神经系统中发挥广泛的生理作用，被广泛应用于创伤愈合、炎症缓解和癌症治疗等领域。然而，由于NO的效应与其在靶向组织中的浓度密切相关，过量或不足的NO释放可能导致氧化应激、血管扩张异常和组织损伤等病理状态。因此，如何实现NO的精准控制和靶向释放成为治疗中的一大挑战。传统的NO供体如NONOates由于在生理条件下的自发分解，难以实现NO的可控释放。为解决这一问题，酶-前药治疗系统（Enzyme-Prodrug Therapy, EPT）应运而生，通过在特定位点利用特异性酶促反应，实现NO的局部释放。尽管已有多种EPT系统用于NO的释放，但由于大多数使用内源酶，如β-半乳糖苷酶，存在非特异性释放的问题。因此，开发一种无内源酶干扰、靶向性强的酶-前药组合至关重要。
针对此，上海交通大学生命科学技术学院杨广宇研究员和南开大学赵强教授合作，创新性地开发了一种基于内切纤维素酶（Cel5A-h38）和纤维二糖苷前药的NO靶向释放EPT系统，为缺血性疾病的精准治疗提供了新方案。他们设计了一种新型前药化合物——纤维二糖基-NONOate（Cel2-NO），在生理条件下和内源性糖苷酶存在时非常稳定，只有在与特定的内切纤维素酶（Cel5A-h38）相遇时，才会被激活释放NO。Cel5A-h38精准识别水解Cel2-NO中的纤维二糖键，并且对人体内的其他糖苷键不起作用。这种独特设计的EPT系统在多个体内外实验中表现出优异的生物正交性，确保了NO的高效靶向释放，避免了传统治疗方法中的全身性副作用。
图1 内切纤维素酶触发NO控释酶-前体药物治疗（EPT）系统的构建
为了进一步了解基于内切纤维素酶和纤维二糖保护的EPT系统的体内特异性和效率，研究团队设计了一种纤维二糖基近红外荧光成像探针（EANP）。该探针利用纤维二糖基作为底物，并结合自解脱连接子与近红外荧光染料（mCy-Cl）像。在Cel5A-h38的作用下，探针被水解，释放出强烈的近红外荧光信号，从而实现酶促反应的监测。体外实验表明，Cel5A-h38能够显著增强荧光信号，表现出良好的灵敏性和特异性。在小鼠体内实验中，研究团队通过将含有Cel5A-h38的水凝胶植入小鼠后肢，并注射EANP，观察到目标区域的荧光信号显著增强，证明了该探针在体内的可控性和靶向性。这一结果进一步证实了基于内切纤维素酶的EPT系统能够有效避免内源性酶的非特异性激活，实现精准的靶向药物递送。
图2 靶向递送一氧化氮可减轻缺血损伤并增强血流灌注
为评估EPT治疗系统靶向释放NO在缺血性治疗中的潜力，研究团队建立了小鼠后肢缺血模型。结果表明，与单独使用Cel2-NO或生理盐水相比，Cel2-NO + Cel5A-h38组显著提高了血流灌注，并有效减少了缺血性损伤。在该组中，小鼠的肢体保留率超过50%，坏死和肢体丧失率显著降低。此外，激光多普勒灌注成像（LDPI）数据显示，Cel2-NO + Cel5A-h38组在手术后21天的血流恢复率是其他组的两倍以上，表明NO的精准释放显著促进了缺血组织的血流恢复和再生。
图3 一氧化氮靶向递送减轻小鼠缺血损伤
研究还评估了NO靶向释放对缺血疾病中炎症反应的调控作用。结果显示，NO的靶向释放促进巨噬细胞由促炎的M1型向抗炎的M2型转化，显著减少了M1巨噬细胞的浸润，并增加了M2巨噬细胞的数量。同时，Cel2-NO + Cel5A-h38组的促炎基因（IL-6、TNF-α、IFN-γ）表达显著下调，而抗炎基因（Fizz-1、Arg-1、IL-10）的表达显著上调。这表明NO通过调控炎症反应，促进了缺血组织的修复和再生。
图4 一氧化氮靶向递送调节小鼠后肢缺血模型的炎症反应
通过组织学分析，研究评估了NO靶向释放对缺血性后肢的治疗效果。结果显示，与对照组相比，Cel2-NO + Cel5A-h38组在7天时显著减少了肌肉纤维化和坏死，并在21天时改善了肌肉细胞退化、炎症细胞浸润和脂肪沉积。Masson三色染色结果表明，NO的靶向释放有效抑制了胶原沉积，减少了纤维化的发生。此外，CD31免疫荧光染色显示Cel2-NO + Cel5A-h38组在7天时毛细血管密度显著增加，并在21天时几乎恢复至正常水平，表明该系统促进了血管新生和组织再生。
图5 一氧化氮靶向递送促进小鼠后肢缺血模型的肌肉恢复
总而言之，这一创新的酶-前药治疗系统不仅为缺血性疾病的治疗带来了新的思路，还为未来气体信号分子的靶向递送提供了有力支持，代表了药物递送系统领域的重大突破。
相关工作被选为当期的内封面文章。本研究得到了国家重点研发计划、国家自然科学基金和上海市基础研究试点项目的支持。上海交通大学博士后何波和南开大学博士生张亚婷为论文的共同第一作者，杨广宇研究员和赵强教授为共同通讯作者。
图6 该工作作为内封面文章发表
论文信息：
An Endocellulase-Triggered NO Targeted-Release Enzyme-Prodrug Therapy System and Its Application in Ischemia Injury
Bo He, Yating Zhang, Huaping Liu, Manuel Tang, Ke Yang, Silian Cheng, Jie Shen, Yongzhen Wei, Weiliang Deng, Qiang Zhao*, Guang-Yu Yang*
Advanced Healthcare Materials
DOI: 10.1002/adhm.202401599
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Advanced
Healthcare
Materials
期刊简介
该刊于2012年从Advanced Materials中独立出来单独成刊。期刊发表有关提升人类健康的材料、器件、技术等最新研究成果，具有国际化的交叉学科影响力。
WILEY
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