文章来源：临床与实验病理学杂志,2024,40(10):1012-1017肿瘤的发生过程复杂多变，针对肿瘤的治疗手段不断在发展。免疫检查点抑制剂(immune checkpoint inhibitors, ICIs)在大量实体瘤中获得了持久反应。然而，并非所有患者均能从中受益，这就需要可靠的生物学标志物来筛选适宜人群和预测免疫治疗疗效。三级淋巴结构(tertiary lymphoid structures, TLSs)是位于肿瘤微环境(tumor microenvironment, TME)中的异位淋巴组织，主要是以聚集成团的B细胞为核心，外周围绕T细胞，形成滤泡样结构。此外，成纤维细胞形成的基质网络提供了TLSs发生的结构支撑，位于外周的高内皮微静脉(high endothelial venules, HEVs)作为一种特化的血管通过招募淋巴细胞聚集提供了TLSs发生的启动基础。树突状细胞(dendritic cells, DCs)、滤泡树突状细胞(follicular dendritic cells, FDCs)、巨噬细胞、中性粒细胞以及浆细胞也分布于TLSs中。不同细胞可被不同的标志物染色，用于TLSs的鉴定和识别。近年国内外的研究结果证实，实体瘤TLSs的形成象征免疫细胞的浸润及对肿瘤杀伤作用的增强，是免疫治疗的重要组成部分，与免疫治疗的疗效和患者预后密切相关。基于其对肿瘤免疫治疗的预测作用，TLSs已成为生物学标志物研究的热点之一，但仍缺乏完善统一的TLSs病理评估方法。因此，亟需提高对TLSs检测与判读的认识，本文将对此进行系统阐述，以增加病理医师在工作实践中的理解与共识。随着医学的进步，实体瘤治疗方案的选择也逐渐多元化，目前主要手段包括手术、放疗、化疗、免疫治疗、靶向治疗和联合治疗。针对免疫治疗组织样本的TLSs病理评估已被证实可以预测患者免疫治疗的疗效。TLSs的存在、密度、成熟度、某些组分、基因标签均与良好的治疗反应和预后有关。Gao等在针对尿路上皮癌患者的程序性细胞死亡受体-配体1(programmed cell death-Ligand1, PD-L1)联合细胞毒T淋巴细胞相关抗原-4(cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4, CTLA-4)阻断的研究中发现，有反应患者治疗前肿瘤组织中TLSs的密度比无反应者明显更高，且与总生存期(overall survival, OS)和无进展生存期(progression free survival, PFS)显著相关，作者进一步分析发现有反应患者治疗前TLSs中B细胞、CD4+T细胞和CD8+T细胞的密度比无反应者更高，并推导了一个由POU2AF1、LAMP3、CD79a和MS4A1组成TLSs的4基因标签，发现应答者的基因标签表达明显高于非应答者。在其他实体瘤的研究中也证实TLSs预测免疫治疗反应和患者预后的积极作用。
近年，PD-L1虽是应用最广泛的免疫治疗预测标志物，但仅20%~40%的患者能够从程序性细胞死亡受体-1(programmed cell death protein-1,PD-1)/PD-L1抑制剂治疗中获益。Vanhersecke等在对3个接受抗PD-1/PD-L1治疗的独立癌症患者队列的大规模回顾性分析中发现，成熟TLSs与改善的客观缓解率(overall response rate, ORR)、PFS和OS相关，并与PD-L1的表达和CD8+T细胞密度无关。这些结果为应用TLSs来选择更可能受益于免疫治疗的患者提供充足的证据。通过对实体瘤TLSs的病理检测及结果判读，使免疫治疗反应和患者临床结局的预测更精准快速，为术后治疗方案的选择提供理论依据。总之，鉴于实体瘤TLSs病理检测的重要临床意义，对于可获及的肿瘤组织可以进行TLSs的病理检测与评价。同时，在检测前需进行充分的临床病理沟通，有助于检测结果的正确解读及免疫治疗的客观评价。在检测后应与患者的临床病史资料对比，查看是否相符，如免疫治疗的疗效、患者预后等，当出现结果不符时应进行复核或重复检测。
2. TLSs病理检测的方法和流程
2.1 TLSs病理检测的标本类型和前期处理
(1)标本类型：手术切除标本、麦默通标本、穿刺活检标本以及各标本类型的原发灶、转移灶、复发灶或治疗前后的病灶均可进行TLSs检测，并分别评估，给予临床充分提示。所有标本的处理均需严格按照各实体瘤取材规范进行。考虑到标本的可及性、细胞数量和细胞结构的完整性等因素，优先推荐在术后切除的福尔马林固定石蜡包埋(formalin-fixed paraffin-embedding, FFPE)组织中进行TLSs病理检测，并应充分评估每张HE染色切片中TLSs的情况，必要时选择具有代表性的蜡块进行相关免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)染色／免疫荧光(immunofluorescence, IF)染色和多重免疫组织化学(multiplex immunohistochemistry, mIHC)染色／多重免疫荧光(multiplex immunofluorescence, mIF)染色。(2)标本固定：推荐在标本离体后1h内应用适当体积的10%中性福尔马林固定，小活检标本一般需固定6~12h,术后大标本需在切开后固定12~48h。(3)组织切片：①应保证切片完整，无明显的脱片、缺损、打褶和卷片现象；②用于HE染色的切片厚度推荐为4~6μm,用于IHC/IF染色的切面厚度推荐为3~5μm;③未染色的白片应注意保存条件和保存时限，置于室温不可超过6周，置于-4℃冷藏不可超过6个月；④染色后的切片可置于室温长期保存。推荐使用FFPE组织进行TLSs检测，尽量避免使用坏死组织较多或固定欠佳的蜡块。暂不推荐细胞学标本、沉渣包埋组织和脱钙骨组织进行TLSs病理检测。
2.2 TLSs病理检测的方法和推荐流程
TLSs病理检测的方法主要包括：HE染色、IHC/IF染色、流式细胞术(flow cytometry, FCM)、分子病理检测。(1)HE染色：其是表征TLSs最核心、最基础的技术。基于组织形态学能直接观察到TLSs的数量、密度、形态及位置。(2)IHC/IF染色：通过对不同肿瘤浸润淋巴细胞(tumor infiltrating lymphocytes, TILs)的标记，可以区分不同亚型和成熟度的TLSs，并进行定量和定位分析。mIHC/mIF染色可以在一张切片上标记多种TLSs相关的免疫细胞，直观地表征TLSs结构，是目前TLSs研究领域中常用的技术之一。(3)FCM：可以从肿瘤新鲜组织中分离出特定细胞，与应用FFPE组织进行IHC/IF染色得到的结果进行相互验证，并通过检测相关细胞因子的含量探索该细胞的功能。例如，在口腔鳞状细胞癌中同时应用IHC和FCM检测，可发现与良好预后相关的TCF1+/TCF7+T细胞低表达检查点分子T细胞免疫球蛋白及黏蛋白结构域分子-3(T cell immunoglobulin domain and mucin domain-3, TIM-3)、T细胞免疫球蛋白和ITIM结构域蛋白(T-cell immunoglobulin and ITIM domain, TIGIT)、淋巴细胞激活基因-3(lymphocyte activation gene-3, LAG-3)、CTLA-4和PD-1,高表达刺激分子CD28、Ki67、TLSs相关因子CC类趋化因子受体7(CC chemokine receptor 7, CCR7)和效应因子白介素2(interleukin2, IL2)。在另一项对透明细胞肾细胞癌的研究中发现CXCL13+CD8+T细胞的细胞丰度与较低的OS和PFS相关，通过IHC和FCM检测发现该细胞高表达免疫检查点分子和Ki67,低表达肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)和γ-干扰素(interferon-γ, IFN-γ)。(4)分子病理检测：通过RNA测序和转录组分析可以获得TLSs相关的基因标签。虽然TLSs最常见的表征方式是HE结合IHC或IF染色，但是随着测序技术的发展，TLSs的分析已步入转录组水平。目前最常见的测序手段是单细胞RNA测序(single-cell RNA-sequencing, scRNA-seq)和空间转录组测序(space transcriptome sequencing, ST-seq)。最常见的TLSs基因标签是一个包含CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL8、CCL18、CCL19、CCL21、CXCL9、CXCL10、CXCL11和CXCL13的12-趋化因子基因标签(12-chemokine gene signature)，已被广泛证实与多种实体瘤的生存和免疫治疗的疗效相关。
总之，TLSs的病理检测方法多样，并且各有优缺点（表1),合理地整合这些手段能确保TLSs在预测预后和判断疗效方面的应用更加规范。推荐使用的TLSs病理检测流程是：首先进行HE染色；当HE染色无法区分TLSs的分化程度时，需要进行IHC/IF染色。有科研需求的单位可以采集新鲜组织进行FCM和分子病理检测。需要注意的是，各种检测方法均应与HE染色同步进行。
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TLSs病理评估的首要任务在于明确HE染色切片上是否存在TLSs。若存在TLSs,应判断其位置、数量及分化程度。对于HE染色无法判读TLSs分化的患者，应借助IHC/IF染色区分出TLSs的分化程度（是否成熟）。有科研需求者，建议取新鲜组织样本进行FCM和分子病理检测。TLSs病理评估的核心是HE染色后镜下识别致密淋巴组织聚集物。基于组织形态学可以明确定义包含生发中心(germinal centers, GCs)的成熟TLSs,并能直接观察到TLSs的数量、大小、形态及位置，但无法识别B细胞区和T细胞区的边界，也无法区分非典型的TLSs或其他非TLSs的淋巴细胞聚集体。需要注意的是，评估时需排除肿瘤中有坏死、纤维化、破碎不整形区域以及支气管周围的地带，也要排除正常淋巴结构区域。(1)关于TLSs存在的判读：当肿瘤床上及肿瘤侵袭边缘均未见免疫细胞、肿瘤床上存在少量散在的免疫细胞但未见明确聚集时可判定为TLSs阴性。目前TLSs阳性的定义尚无统一的标准，有将=2个淋巴物聚集体定义为TLSs阳性,也有将淋巴细胞聚集面积大于显微镜视野400倍(0.0312 5mm2)者定义为TLSs阳性,近期发表的一项队列研究将淋巴细胞数量＞50个定义为TLSs阳性。因此，综合既往研究数据推荐TLSs阳性判读标准为聚集的淋巴细胞数量＞50个或面积＞1个高倍镜视野(high power field, HPF)。(2)关于TLSs位置的判读：首先，按TLSs存在的空间位置可分为肿瘤内、肿瘤侵袭边缘和肿瘤旁。需要强调的是，对于肿瘤侵袭边缘的界定有基于范围的（从浸润性肿瘤的最外侧边缘开始标注，延伸最大径为250μm)和基于距离的（与肿瘤细胞距离<1mm的纤维组织内）。Ding等在肝内胆管细胞癌的研究中发现，瘤内TLSs与良好预后有关，而瘤周TLSs与较差的预后相关，表明TLSs所在的位置不同，可能通过不同的免疫机制起到抑癌或促癌作用。其次，按TLSs在管腔组织内的浸润位置分为浅层和深层，作者通过比较浅层（黏膜下）和深层TLSs的免疫细胞组成和成熟阶段，发现浅层TLSs具有更明显的辅助T细胞(helper T cell, Th)和早期TLSs的富集。此外，浅层TLSs显示出较低比例的次级滤泡。因此，综合既往研究数据推荐TLSs的位置判读主要包括肿瘤内、肿瘤侵袭边缘和肿瘤旁。其中对于肿瘤侵袭边缘的定义是指与肿瘤细胞距离<1mm的纤维组织内（图1)。另外对空腔脏器中TLSs浸润深度的位置可以进行浅层和深层的判读，但不作为常规推荐。(3)关于TLSs数量的判读：推荐在全视野数字切片(whole slide image, WSI)中计数每10个HPF中TLSs的数量。量化为0代表0个TLSs;1+代表1~5个TLSs;2+代表6~10个TLSs;3+代表＞10个TLSs。(4)关于TLSs分化的判读：TLSs的发展经历了连续的成熟阶段。已经有文献对TLSs的分化过程有了初步的定义。大多数研究者认为CD20+B细胞、CD3+T细胞和HEVs聚集在一起，并有CD21+FDCs以及CD23+GCs的存在就可以被认定为成熟TLSs。有研究表明在某些肿瘤中含有成熟TLSs的患者呈现更低的复发率和更长的生存期。本文推荐在HE切片上进行的判读应充分评估淋巴细胞聚集体的程度，当淋巴细胞聚集在一起，且无明显滤泡结构时应判读为早期TLSs;当淋巴细胞聚集在一起形成淋巴滤泡，且无明显GCs时应判读为初级TLSs;当淋巴细胞聚集在一起形成滤泡结构，且可见明显GCs时应判读为次级TLSs（成熟TLSs)。![]()
此外，随着人工智能(artificia lintelligence, AI)的迅速发展，数字病理应用正在逐渐普及。Barmpoutis等提出了基于HE切片的组织形态学来检测TLSs的方法，他们观察发现TLSs中淋巴细胞的最小数量是45,而最小的面积是6.245μm2,在TLSs中淋巴细胞的平均密度为0.0128μm2,约是非TLSs区域(0.004μm2)的3倍，提示我们可以通过TLSs内的淋巴细胞数量、TLSs的最小面积和给定区域内的淋巴细胞密度的标准来定义TLSs。也有学者应用Zeiss Axioplan软件的自动化工具对TLSs进行形态计量学分析以计算平均数量和大小。由此可见，AI通过计算机学习可以提供一种快速可靠的自动识别和量化方法,为TLSs的智能化判读提供思路。
3.2 IHC/IF的判读
(1)何种情况下需要进行IHC/IF检测：当HE染色不足以诊断TLSs的分化或需要更全面的分析时，可使用IHC/IF的抗体辅助TLSs的病理检测及判读。此外，需要对TLSs中某些具体细胞亚型进行定量和定位分析时，可使用IHC/IF进行辅助判断（表2)。(2)必用检测抗体的选择：主要包括CD3、CD20、MECA-79/PNAd、CD21、CD23。CD3是最常用的T细胞标志物。CD20是最常用的成熟B细胞标志物。MECA-79/PNAd是HEVs的特异性标志物，既往研究发现HEVs不规则的细胞高度和较强的变形能力可以允许淋巴细胞外渗并促进淋巴细胞归巢，作为TLSs的重要组成部分，MECA-79/PNAd阳性的HEVs与TILs的浸润及患者的良好预后呈正相关,上述3种抗体标记的T细胞、B细胞和HEVs共同组成TLSs的基本结构。CD21是C3d的互补受体，表达于FDCs的细胞膜，由于FDCs分布在滤泡GCs且有丰富的细胞突起交错连接，形成特征的“渔网状”外观，并可以显示滤泡中FDC网。CD23是一种低亲和力IgE受体，主要表达于成熟的B细胞和FDCs,可用于标记GCs的活化B细胞。总之，CD21和CD23的联合应用可辅助鉴别TLSs的分化程度（图2):①把含有HEVs的TLSs称为早期TLSs,该阶段无CD21和CD23的表达；②把含有HEVs和FDC的TLSs称为初级TLSs,该阶段有CD21表达、无CD23表达；③把含有HEVs、FDCs和GCs的TLSs称为次级TLSs,也称为成熟的TLSs,这一阶段同时表达CD21和CD23。(3)检测抗体的选择：主要包括CD4、CD8、CD10、BCL6。前两项可以辅助判断TLSs中不同T细胞亚群的数量、比例和分布情况，CD10和BCL6均是GCs的标志物，同样可辅助鉴别TLSs的分化程度。(4)科研抗体的选择：主要包括CXCL13、TCF1、TCF7。CD4阳性的滤泡辅助T细胞(follicular helper T cell, Tfh)可通过产生CXCL13诱导CXCR5+B细胞的迁移，促进TLSs中GCs的形成。GCs形成后会产生亲和成熟和类别转换的B细胞，识别抗原并释放抗肿瘤抗体，进而产生记忆性B细胞和持久的体液免疫，同时B细胞向CD8+T细胞呈递抗原以激活其免疫杀伤功能。TCF1是由TCF7编码的重要T细胞调节因子，TCF1+CD8+T细胞存在于肿瘤中，并与免疫治疗后的良好临床结局有关。![]()
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3.3 FCM和分子病理的判读
FCM的判读主要针对靶细胞或者靶分子进行，有科研需求的单位可进行相关的检测及判读。分子病理检测的判读主要是针对基因标签。由于肿瘤异质性和人群异质性的存在，目前获得的TLSs基因标签及其相关的趋化因子标签也不尽相同。除12-趋化因子基因标签外，胃癌中与辅助性T细胞1(helper T cell 1, Th1)和B细胞相关的19个基因标签、乳腺癌中与Tfh细胞相关的8个基因标签、头颈癌中与B细胞相关的8个基因标签以及卵巢癌中与浆细胞相关的2个基因标签也可以表明TLSs的存在。近期在一项对Merkel细胞癌的研究中，5个趋化因子标签也被提及。由于TLSs强调多细胞聚集体的空间特征，因此单纯的scRNA-seq技术不能完整地解读其结构和功能，新兴的ST-seq技术可以解决该难题。如Meylan等通过整合scRNA-seq、ST-seq、IHC、mIF及AI,可以证明TLSs是B细胞成熟、选择、克隆扩增和同型转换的位点。值得注意的是，Andersson等开发了应用线性回归模型(linear regression model)识别基于基因表达的TLSs方法，不仅可以从模型参数中提取基因特征，还可以基于TLSs评分进行临床预后预测。未来，TLSs的基因标签及AI辅助评分将会有更多的研究数据，为TLSs的分子病理检测提供参考。
规范的实体瘤TLSs检测报告应至少包含以下内容（表3)：(1)患者的基本信息；(2)样本信息（包括样本类型和组织病理诊断）；(3)检测方法(HE、IHC、IF、FCM、分子病理）；(4)根据TLSs分类出具的判读结果，包括存在、位置、数量、分化、组分、基因标签；(5)组分和基因标签尚不作为常规推荐。
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病理技术人员应保证FFPE组织和HE切片的质量控制，确保操作流程的规范化。IHC或IF实验室应保证TLSs检测平台的稳定性和准确性。病理诊断医师应保证TLSs评估的熟练性和一致性。病理检测及判读推荐参照标准流程进行（图3)。质量控制包括室内质量控制与室间质量控制。在室内质量控制中，要求对从业人员进行规范化培训和定期考核，对所有实验结果进行登记存档和回顾总结。在室间质量控制中，要求定期参加国内权威认证的质控活动，并与其他实验室沟通交流，对比检测及评估结果的可信度。
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本文详细阐述实体瘤中TLSs病理检测的样本制备、具体方法、结果判读及质量控制，并推荐使用实体瘤TLSs病理检测报告模板，具有可操作性和可重复性，为广大病理工作者提供参考。然而，建立标准化的TLSs检测与判读的相关指南与共识，尚需要更多的循证医学证据。
文章来源:临床与实验病理学杂志,2024,40(10):1012-1017
DOI:10.13315/j.cnki.cjcep.2024.10.002
