质粒对每一个奋战在生物实验室的科研人而言，想必是最熟悉的实验伙伴了，其作为分子遗传学的起源和现代生物技术中最常用的基因载体，重要程度不言而喻。
科学的长河缓缓流动，生化实验室不能失去质粒，正如西方不能失去耶路撒冷。
然而，实验室批量制造的质粒的真实性和质量评估如何保证？其质量直接关系到研究的准确性和可靠性，质粒设计的错误和缺陷会造成实验结果的偏差甚至实验失败。
夜以继日、辛辛苦苦地完成数个实验，却发现从一开始质粒便是错的，这是多么痛的教训！
图源：知乎
有网友用亲身经历表示想要验证质粒是否构建无误，除了测序测通，还要酶切鉴定。
有网友表示自己被不负责任的生物测序公司摆了一道，质粒测序不对，被一个错误的质粒白白浪费了一个月的时间！
50% 的实验室质粒设计和使用存在漏洞与缺陷
上述血泪史并非偶然，近日一项研究显示，近 50% 的实验室质粒存在明显的设计缺陷及序列错误。
这项触目惊心的实验结果来自云舟生物首席科学家蓝田博士团队在 bioRxiv 发表的研究论文 Prevalence of errors in lab-made plasmids across the globe。
该论文对来自北美、欧洲和亚洲等全球多个地区的实验室的 2500 多个质粒进行了深入分析，发现约 15% 质粒存在明显的设计缺陷（启动子位置错误、编码序列不正确及注释错误等）。
约 35% 质粒的直接测序结果表明，其重要功能区域实际序列与理论参考序列存在差异（点突变、插入突变、缺失突变及序列重排等）。
还有毒性基因混入质粒中，或对科研和临床研究具有重大负面影响，提示科研人必须充分警惕！
图源：bioRxiv
质粒错误引发的连锁效应
上述论文呼吁人们对于实验室 DIY 质粒可靠性应该有深度思考与对应措施，这并非危言耸听，而是实打实的血泪教训！
有人曾因错误的质粒被撤销了博士学位。
早在 2018 年 10 月 30 日，东京医科牙科大学 Yuxiong Lu 等人在 Biochemistry and Biophysics Reports 上发表研究论文 Doublecortin-like kinase 1 compromises DNA repair and induces chromosomal instability，认为丝氨酸/苏氨酸激酶（DCLK1）通过基因组不稳定性干扰 DNA 修复并诱导肿瘤发生，并且该功能与激酶活性和微管调控无关。
时隔两年，杂志编辑部发布了撤稿声明，理由是该研究使用的质粒保藏到 Addgene，Addgene 进行的下一代测序揭示 C－末端区域有一个移码，这导致了人工的 C－末端序列，引发后续一系列转染和表达问题，细胞鉴定结果显示 MCF10A 可能被 HEK293 细胞污染，最终推翻了 DCLK1 引起染色体不稳定的结论。
图源：Biochemistry and Biophysics Reports
2021 年 4 月 26 日，该论文作者的博士学位被东京医科牙科大学撤回。多年的求学时光与辛勤努力付之一炬，这是多么令人遗憾与惋惜。
图源：东京医科牙科大学官网
无独有偶，2022 年 5 月，瑞典斯德哥尔摩大学 Hui Jiang 等人在 Viruses 杂志发表的论文被撤稿，原因也涉及错误的质粒使用和实验设计，即不当的实验设计有可能严重影响所得实验数据的完整性。
图源：NCBI
编辑部认为，该论文包含所选择的含有 c 端与 6xHis 标签融合的刺突蛋白质粒，以及在方案中过表达条件下使用 GFP 报告系统，都被鉴定为有可能引入引发模糊的实验结果。
因此，论文结果和结论的可靠性受到了损害。
此外，关于刺突蛋白对后天免疫系统的影响的陈述是误导性的，既没有进行与后天免疫系统相关的实验，也没有研究基于刺突蛋白的疫苗。
看来，质粒序列出现问题会引发实验失败，不结合实际、不分青红皂白随意使用质粒也会给实验结果造成灭顶之灾。
质粒错误只是冰山一角
近年来各类论文打假、撤稿屡见不鲜，除了上述提到的质粒污染和错误引发的撤稿，细胞污染、基因组污染同样给人们敲响了警钟。
据统计，因使用误用细胞系导致论文被撤稿的事件层出不穷。
据统计，大约六分之一研究人类细胞的科研人员使用了错误的细胞系，3 万余篇的研究论文因细胞系的错认而纷纷阵亡。
2010 年，澳大利亚细胞库 Amanda Capes-Davis 等人在《国际癌症杂志》(International Journal of Cancer) 上发表重磅综述，呼吁科研人们需要鉴定细胞系。
并罗列了一份交叉污染或被错误识别的细胞系清单，列出了 438 个假细胞系，HeLa 细胞是该数据库中最常见的污染物，造成了 24% 的假细胞系来源。
这个假细胞系数据库现在由国际细胞系认证委员会 (ICLAC) 管理。
图源：International Journal of Cancer
除了细胞污染，基因组污染也令人头大，Science 论文曾被飞速撤稿。
2022 年 12 月 1 日，研究论文 Gradual emergence followed by exponential spread of the SARS-CoV-2 Omicron variant in Africa 发表在顶尖学术期刊 Science 上。
该研究提出在新冠病毒 Omicron 突变株首次被发现（2021 年 11 月）之前，它的祖先就已经在非洲广大地区逐渐出现和进化。
图源：NCBI
然而，反转很快出现，这项重要的结论上线不到一个月，便被撤稿，令人大跌眼镜的参与该论文的 87 位研究人员承认，该研究样品的关键基因组序列被污染，因此导致了错误结论。
Science 期刊主编 Holden Thorp 和论文的通讯作者、柏林夏里特医学院的 Jan Felix Drexler 对此乌龙事件均表示了歉意和后悔。
科研的严谨和精确不容忽视
与蓄意造假相比，质粒错误、细胞系污染和基因组污染等一系列问题似乎显得主观性没那么强。
然而，科学的本质是严谨和精确，倘若失去了这两个标准，那么科学真理便不再令人信服。
以如何避免质粒错误为例，便需要从源头出发最大程度地减少质粒构建的错误。
蓝田博士带领的研究团队建议在质粒构建过程中实施标准化的质量控制措施，使其与研究和治疗应用中的其他重要质量标准保持一致。
具体包括：
（1）标准化设计原则：为所有主要的研究和治疗应用建立一套标准化的质粒设计原则。
（2）最佳实验方案：在质粒的构建、扩增、储存、转移和质量控制，以及相关试剂，如文库和重组病毒的处理中采用最佳实验方案。
（3）专业知识共享：建立机制，鼓励研究人员分享他们在质粒方面的专业知识，特别是提高载体性能和避免错误陷阱的技巧。
上述原则均适用于其他实验过程，标准化、最佳化与专业知识共享化。
正如蓝博士所言，这些严重的问题之所以长期未被发现，主要是因为使用者未曾怀疑过它们的质量，但其严重性逐渐被科学界所关注到。
对于我们每一个科研人而言，亦是如此，要抱有一颗求真去伪的好奇心与责任心，务必要爱惜个人羽毛，不管因何种原因被撤稿，均会给自己学术生涯留下不可磨灭的污点。
如此，方能最大程度地减少对自己、对后来研究者的影响！
