缺血性脑卒中/脑梗对人类健康构成严重威胁，是全国和全球范围内死亡和身体伤害的第三大原因。中风的高发病率、残疾率和死亡率给家庭和社会带来了沉重的负担。为了有效地选择治疗缺血性中风的药物，提高治愈率和康复率，建立接近人类梗死的大脑中动脉闭塞（MCAO）再灌注模型一直是研究人员面临的挑战，而使用稳定的动物模型是研究此类疾病的最重要工具之一。本文从实验动物的选择、线栓材料的选择、线栓的制作和加工、外部环境和手术的影响等方面介绍了研究SD大鼠大脑缺血再灌注实验动物模型制作的全部过程，为科研工作者提供长期稳定的SD大鼠大脑缺血再灌注模型，并最终提高实验动物模型的成功率和可行性。
2.1实验动物的选择
实验研究的前提是选择合适的实验动物模型：大脑缺血再灌注MCAO疾病模型，创造了一个高度复制人类临床脑血管疾病的动物模型，包括了临床病人的疾病特征，这对于临床研究脑缺血的发病机制和药物筛选非常重要。狒狒和食蟹猕猴的颅神经中枢与人类非常相似，但它们价格昂贵且难以饲养。犬大脑的血管床与人类的明显不同，它有一个广泛的颈内动脉和颈外动脉的吻合网络。在兔子中，大脑皮层发育不全，无法提供稳定的病理模型[1]。目前，大鼠是最常用的实验研究动物，因为其饲养成本低，繁殖快。因此，大鼠是目前研究心血管疾病最常用的实验动物之一。在大鼠中建立的大脑缺血再灌注实验动物模型是比较好再现的，因为大鼠的繁殖特点与人类相似，CT中脑组织的病理变化与医院中观察到的临床病人非常相似。
对于不同体重的大鼠，模型制备的成功率也不同。根据杨章章和陈红[2]的实验，实验动物的体重越低，手术死亡的风险越高，体重小于180g的大鼠手术死亡率达到70%，体重大于350g的大鼠手术死亡率不到10%。然而，体重超过350g的大鼠因为体型较大，拥有较大的血管，这就导致在模拟MCAO时，建模手术成功率相对来说比较低。因此，选择适当体重的大鼠进行模拟是极为重要的。并且因为体重在250-300g的大鼠的生命力强，抗感染，术后容易存活等优点，所以成为模拟MCAO的理想选择[3]。
2.2线栓的选择与制作
Tang等[4]的研究发现，钓鱼线内在属性均一，硬度及弹性非常合适，且头端较为简单即可处理，可作为手术的相对较好的实验材料。近些年来，我国大多数实验动物科研工作者大多使用钓鱼线作为MCAO手术模型的材料。
取熔点为56℃的固体石蜡一块,在瓷杯中加热熔化。取直径为0.24mm、长5cm的钓鱼线，将钓鱼线一端垂直浸入在熔化的石蜡中，浸入长度为5mm，浸入并立即提起即将凝固的薄层石蜡，使其地粘附在钓鱼线的一端可使钓鱼线直径变为0.26mm，就这样普通的钓鱼线即可变成规格一致头端光滑圆钝的栓线。
3.1 手术操作步骤
（1）麻醉及固定。大鼠提前4 h禁食后，进行麻醉。将大鼠四肢和头部固定在操作台上，使颈部延展，剃除颈部毛发，将加热毯设置到恒定37℃，维持大鼠体温。
（2）碘伏消毒后持手术刀片沿颈部正中做一长约2 cm 的切口。随后从两侧颌下腺之间剪开浅筋膜，露左侧胸锁乳突肌，反复钝性分离其与胸骨舌骨肌间的肌间隙，暴露左侧颈总动脉分叉所在之处，该操作过程应避免损伤气管和胸锁乳突肌等组织。
（3）沿左侧颈总动脉分叉处向心脏方向分离颈总动脉（CCA），并对其伴行的迷走神经行钝性分离操作。
（4）分离完迷走神经后，在 CCA深面放置两根细线，其中一根置于靠近 CCA 分叉处，打活结用以随后固定线栓，另一根细线于 CCA的近心端结扎。
（5）随后分离颈外动脉（ECA）和颈内动脉（ICA），用一条细线结扎 ECA，另预备一条细线于 ICA 处，并用血管夹夹闭 ICA。
（6）使用眼科剪在 CCA 上剪一“V”型小口，插入线栓头，将 CCA分叉处的活结系紧，松紧程度以能移动线栓和松开血管夹无血液流出为度。
（7）松开血管夹的同时，迅速将线栓沿着 ICA 插入，阻塞大脑中动脉（MCA）。若线栓进入部分后出现阻力感，提示可能插入翼腭动脉（PPA）。此时切忌继续用力插入，而应将线栓稍往后退，顺血管走向调整角度，避免插入 PPA。
（8）顺利插入线栓后，将 CCA 分叉处的活结再次系紧以固定线栓，并结扎 ICA 处预备的细线。此过程应注意检查 CCA、ECA 均结扎完毕后再行下一步操作，避免因忘记结扎或未结扎紧血管，使得血液返流，导致术中出血过多，影响术后生存率。
（9）若出现术中出血，应保持冷静，迅速找到出血点，用血管夹夹闭，待止血后，再用生理盐水反复冲洗，保持手术视野相对清晰。
（10）术后处理。逐层缝合皮肤，依次用碘伏和酒精消毒颈部后，大鼠放回笼子，俯卧位。室温控制在25±1 ℃[5]。
（11）线栓栓塞按照研究要求造成大鼠脑缺血的需要时间后，大鼠颈部用碘伏消毒，拆除缝合线。小心将线栓拔出至V形切口附近，在切口上方结扎，系死结。用眼科镊夹住线栓全部拔出，恢复血流灌注。逐层缝合皮肤，碘伏消毒后，将大鼠放回笼子，保温，给予充足饲料和水。
3.2 线栓插入深度
对于体重250-300g的大鼠，以超过颈总动脉分叉处18 -22 mm为较为适宜的线栓插入深度，稍有阻力感即止。胡华等[6] 认为当线栓插入深度为10 ～ 15 mm时，大鼠无明显的神经功能缺损；线栓插入深度为18-22 mm时，存在明显的神经功能缺损症状；而线栓插入深度> 22 mm时，大鼠极易昏迷不醒。
4.1 行为学评分
mNSS评分[7]包括运动、感觉、平衡和反射测试，用于评价动物运动、感觉、平衡、反射等神经功能。mNSS 评分0分为正常，18分为严重缺陷。大鼠造模后24 h 按照表1实验项目进行测试，当 mNSS 累计评分≥6 时，可视为 MCAO 模型建立成功。大鼠 MCAO 模型建立成功率表示如下：
4.2 TTC染色测定脑梗面积
TTC（2，3，5—氯化三苯基四氮唑）是呼吸链中吡啶—核苷结构酶系统的质子受体，与正常组织中的脱氢酶反应而呈红色，而缺血组织内脱氢酶活性下降，不能反应，故不会产生变化呈苍白。
将模型动物大鼠安乐死，解剖取材完整的脑组织，在-20℃速冻20min，便于切片。切片切成6片，每隔2mm切一片。将切片至于2%TTC磷酸缓冲液（PH 7.4）溶液中，用锡箔纸盖住培养皿，放入37℃温箱30min，15min后翻动脑切片，使其均匀接触到染液。
SD大鼠MCAO模型作为世界上最通用的模型之一，在其制作时为了达成较高的成功率也需要不断的探索和努力，我们再次总结了难点和问题点，希望这篇文章可以为大家制备模型提供参考。
（1）麻醉时间，麻醉程度适中，过浅影响操作，过深导致死亡。
（2）血管分离，在分离右侧CCA、ECA、ICA时,要注意迷走神经的保护, 减少对迷走神经的损伤, 尽量避免对迷走神经的直接牵拉。
（3）术中状态监护，例如发现呼吸异常，用镊子将大鼠舌头牵拉至嘴角一侧，防止舌头根部堵塞呼吸道出现窒息情况。
（4）手术视野，可以制备金属勾，用橡皮筋缠绕连结金属钩固定在固定板上，从而使手术切口左右上下拉开，扩大手术视野。
（5）线栓插入方向，在插入线栓时，有时只插入约1cm左右，就会出现严重堵塞，这种情况是线栓插入到翼腭动脉，此时有两种方法可供选择，其一，继续分离颈内动脉直至暴露翼腭动脉，用镊子固定辅助线栓方向；其二实验者可以通过将线栓方向调至适宜，并将线栓退出翼腭动脉，重新调整方向从而使线栓顺利进入ICA。
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作者 | 金琪尧
审核 | 彭鱼雁
排版 | 李尖尖
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