手把手教学｜DNA凝胶回收操作步骤和常见问题分析
文摘
2025-01-21 08:03
湖北
PCR扩增产物经过琼脂糖凝胶电泳后，按分子量大小被分开，排列在凝胶中，跟DNAMarker分子量的对比下，找到目的DNA带所在的凝胶，并把它切下来，加热或用特殊的试剂熔解凝胶，使DNA溶回到溶液中，再经过乙醇沉淀或过柱即可获得目的DNA片段。![]()
紫外检测仪、电子天平，恒温水浴锅，台式离心机，快速混匀器，冰箱，灭菌锅、微量移液取样器，移液器吸头，1.5mL微量离心管，双面微量离心管架，水漂，刀片，一次性手套等。实验前把1.5mL微量离心管装入铝制饭盒高温灭菌、移液器吸头装入相应的吸头盒高温灭菌。DNA分子量标准（DNA Marker-D：2000bp，1000bp，750bp，500bp，250bp，100bp）。DNA快速纯化/回收试剂盒（BS363 EZ Spin Column PCR Product Purification ，100次）（500bp以上片段，回收率90%以上），无水乙醇。![]()
1.将PCR反应的混合物转移到一个1.5mL的微量离心管中，加入3倍体积的Binding Buffer Ⅰ。2.将column放入一个2mL的收集管中，转移上一步的混合液到column中，在室温下竖直放置2min，8000rpm离心1min。3.弃去流入收集管中的液体，加500μL Wash Solution到column中，12000rpm离心1min。弃去收集管中的液体，将column放回原来的收集管中。4.再加500μL Wash Solution到column中，12000rpm离心1min。弃去收集管中的液体，再次离心去除残留的Wash Solution。5.将column转移到一个干净的1.5mL微量离心管中。在column中的膜的中央部分加30~50μL Elution Buffer，50℃温浴2min。12000rpm离心1分钟。将PCR产物置于-20℃冷冻保存或即刻使用。（其中，实验操作步骤中所使用的为生工公司的SanPrep 柱式 DNA 胶回收试剂盒Order NO. B518131）紫外下切胶过慢，核酸长时间暴露在紫外线下，结构等可能发生变化，从而失去功能，电泳使所用的电泳缓冲液长时间未更换，pH发生变化，影响DNA吸附。溶液转移至吸附柱加入洗涤缓冲液离心两次后，需要将装有纯化柱的管盖打开，使残留的乙醇挥发以提高得率，最后向纯化柱加入洗脱缓冲液，必须确保缓冲液直接滴在膜上。55℃水浴溶胶时，多次上下颠倒使凝胶充分熔化混匀，确保无固体琼脂糖残留，胶融化后，一般情况下，将呈现下图淡黄色或几乎无色，而若存在部分影响因素会使得溶液pH发生变化，溶液颜色也可能发生改变，如胶块过大使得pH偏高，那么就需要额外添加溶胶液至溶液颜色恢复正常。![]()
尽可能切除不含目的片段的琼脂糖，得到的凝胶体积越小越好（图示左侧为合适大小的胶块，右侧为体积过大的胶块）![]()
要尽可能确保清洁环境下进行操作以减少外源DNA的污染。1.使用试剂盒时，要细致观察使用条件，例如漂洗液中是否加入一定体积的无水乙醇，体积数目根据试剂盒试剂要求而定等。
编辑：胡立学
初审：胡立学
审核：甘 喆
审批：黄 涛
