刊发：Biosensors and Bioelectronics ( IF 10.7 ) Pub Date : 2025-01-10
原著：Tathagata Pal等
2025年新技术进展：
CIMNE-CRISPR：一种用于快速早期检测非洲猪瘟病毒的新型无扩增诊断方法
背景
非洲猪瘟（ASF）继续对全球养猪业造成严重破坏，其病原体是高度传染性和致死性的非洲猪瘟病毒（ASFV）。由于接近100%的致死率和迅速跨境传播的能力，ASFV已成为养猪业的重大威胁。缺乏有效的疫苗和治疗方法使得必须采取严格的控制措施，包括扑杀感染猪群和实施检疫策略。尽管有这些努力，ASFV仍然难以控制，凸显了对快速、灵敏且经济高效的检测方法的需求，以遏制其传播。
传统上，ASFV检测依赖于病毒分离、抗原测量和定量聚合酶链反应（qPCR）。虽然病毒分离被认为是金标准，但它对于实时疾病监测来说太耗时。抗原测量虽然适用于大规模筛查，但缺乏早期检测所需的灵敏度。qPCR尽管具有高灵敏度和特异性，但需要昂贵的设备和熟练的操作人员，从而限制了其在资源有限环境中的应用。这些限制凸显了对结合简单性、速度、灵敏度和经济性的创新诊断方法的需求。
为了应对这些挑战，已经开发了各种核酸扩增技术。环介导等温扩增（LAMP）和重组酶聚合酶扩增（RPA）等技术已被用于提高核酸的检测灵敏度。然而，这些方法由于非特异性扩增而容易产生假阳性，特别是LAMP的复杂引物设计。尽管是等温的，这些技术仍然需要精确的温度控制和专用设备，限制了其在资源有限环境中的可行性。此外，在多个手动步骤（包括小瓶转移）中交叉污染的风险引发了对其可靠性的担忧。这些挑战，加上对熟练操作人员的需求，限制了它们在分散诊断中的广泛应用。
最近，CRISPR-Cas（成簇规律间隔短回文重复序列相关）系统作为新型生物传感技术被探索，展示了在等温诊断检测中的潜力。CRISPR-Cas系统，包括Cas12、Cas13和Cas14，已被用于病毒核酸的检测，因为它们具有增强的特异性、灵敏度、简单性和可编程性。基于CRISPR的检测涉及Cas酶-crRNA核糖核蛋白（RNP）复合物对目标序列的特异性识别，随后通过荧光报告基因的反式切割进行信号放大。这种方法消除了复杂热循环的需求，并实现了即时诊断（POC）应用。然而，基于CRISPR的检测方法尽管有前景，但由于其对核酸扩增的依赖以达到足够的灵敏度，在临床环境中遇到了限制。
为了克服这些挑战，数字检测方法，如液滴微流控和微孔阵列，已与CRISPR-Dx集成，以增强RNA和DNA定量灵敏度。尽管有这些进展，微流控芯片的使用带来了挑战，由于复杂的微加工过程，需要专业技能和时间。此外，新型荧光报告基因的开发为实现更高灵敏度提供了另一条途径，但这些方法通常涉及昂贵的材料，这些材料在传统的CRISPR-Dx中并非必需。
为了解决病毒检测中的限制，最近的研究越来越关注开发既高度灵敏又设计简化的无扩增CRISPR-Cas检测方法。增强检测灵敏度和特异性的方法包括在各种纳米颗粒平台上使用CRISPR LbCas12a-crRNA核糖核蛋白（RNP）复合物。文献强调了在基于CRISPR的检测中增强荧光和信号放大的各种策略。这些包括与二氧化硅纳米颗粒的静电共组装以增强荧光信号，使用金纳米颗粒标记的报告基因以放大反式切割信号，以及用于表面增强拉曼散射（SERS）信号增强的核心-卫星纳米簇。此外，金纳米信标已被用于miRNA检测，形状变化的金纳米双锥体已被用于比色信号生成，实现无扩增的视觉检测。然而，尽管有这些进展，但尚未解决RNP复合物在固体平台上的直接固定问题。与依赖物理吸附或较弱相互作用的传统方法不同，最近的研究强调了共价固定，这可能会显著提高RNP稳定性并最小化背景干扰。例如，对苯二甲醛（TPA）由于其刚性芳香结构，已被研究为比戊二醛更稳定的蛋白质连接剂。研究表明，与戊二醛的柔性脂肪链相比，TPA的结构提供了更好的稳定性和减少的聚集。同时，对替代封闭剂如1-氨基己烷（1AH）的研究表明其在减少非特异性结合事件中的实用性。1AH被认为是传统牛血清白蛋白（BSA）的实用替代品，因为它成本较低，处理更简单，并且不含可能干扰CRISPR-Cas信号产生的蛋白质。此外，具有核壳结构的磁性纳米颗粒，如Fe3O4@SiO2，越来越多地用于现场应用。
基于CRISPR诊断方法和蛋白质固定技术的进步，我们开发了共价固定磁性纳米颗粒增强CRISPR（CIMNE-CRISPR）检测方法，以应对资源有限环境中ASFV检测的独特挑战。该检测方法将目标识别、精确序列富集和稳健的信号生成集成到一个平台中，简化了工作流程，同时最小化污染风险并降低成本。创新地使用TPA作为连接剂和1AH作为封闭剂增强了固定稳定性并减少了非特异性相互作用。该系统通过先进技术（包括TEM、STEM-EDX、zeta电位分析和FTIR光谱）进行了全面表征，确认了组件的精确合成和生物共轭。功能评估包括通过凝胶电泳验证的顺式和反式切割活性，以及RNP负载、磁性纳米颗粒数量、孵育时间和反应条件的广泛优化。CIMNE-CRISPR检测显示出强大的生物传感能力，即使在高突变浓度下也能保持特异性。它在猪血浆中实现了ASFV DNA的无扩增检测，具有高灵敏度。这种经济高效且用户友好的方法非常适合实时现场诊断，并在农业和人畜共患病检测中具有广泛的应用。
CIMNE-CRISPR系统的检测机制如图1所示。LbCas12a核酸酶已成功表达并纯化，方法遵循我们之前报道的方法（Ci等，2024）。LbCas12a核酸酶通过SDS-PAGE进行了表征和确认（图S1）。核壳结构的Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒（MNP）通过水热法合成（Chen等，2016），并进行了功能化处理，以便与LbCas12a-crRNA核糖核蛋白（RNP）复合物进行共价生物共轭。crRNA专门设计用于靶向ASFV的B646L基因，这是一个高度保守的序列，编码vp72蛋白，这是病毒感染所必需的关键蛋白。该靶区域包括原间隔相邻基序（PAM），这是LbCas12a酶识别并特异性结合和切割的必需序列（表S1）。CIMNE-CRISPR检测方法直接从样品中富集目标DNA，无需扩增，简化了工作流程。将系统引入含有目标DNA的较大体积血浆后，RNP复合物选择性地结合到PAM位点的目标序列上。然后通过磁分离富集复合物并去除非特异性背景成分。上清液随后被替换为单链DNA荧光-淬灭（ssDNA-FQ）探针。LbCas12a通过与结合的目标DNA激活，启动探针的反式切割，产生与目标DNA浓度成比例的荧光信号。这种无扩增方法确保了快速、灵敏且特异的ASFV检测。
结果
CIMNE-CRISPR系统在复杂生物基质中检测ASFV DNA的有效性通过向猪血浆中添加不同浓度的ASFV DNA进行了评估。检测工作流程如图6a所示。血浆作为一种复杂的生物流体，含有蛋白质（白蛋白、球蛋白）、脂质、电解质和其他生物分子的混合物，这些成分可能会通过增加背景噪声干扰核酸检测。尽管存在这些复杂性，CIMNE-CRISPR检测方法仍被测试以评估其在真实诊断场景中的稳健性和潜在适用性。使用CIMNE-CRISPR检测方法分析了添加了不同浓度ASFV DNA的猪血浆样品，并获得了荧光光谱（图6b）。观察到荧光强度的浓度依赖性增加，表明该系统在存在血浆干扰的情况下仍能检测ASFV DNA。在图6c中，展示了该检测方法的定量性能及荧光图像，动态范围内观察到强线性回归（插图）。如图6c所示，在10^5到10^10拷贝/μL的范围内，荧光强度与ASFV浓度之间存在稳健的线性关系（Y=2089X-9066，R^2=0.96）。基于对照重复的平均值（n=3）加上三倍对照标准偏差，计算出检测限（LOD）低至8.1 x 10^4拷贝/μL，定量限（LOQ）为4.2 x 10^5拷贝/μL。CIMNE-CRISPR系统在不同浓度下检测ASFV DNA的荧光图像进一步证实了该方法在存在复杂血浆成分的情况下仍能准确区分浓度水平的能力。
4.结论
共价固定磁性纳米颗粒增强CRISPR（CIMNE-CRISPR）系统为非洲猪瘟病毒（ASFV）提供了一种新型的无扩增诊断平台，解决了传统方法的关键限制。通过无缝整合精确的目标识别、序列特异性富集和基于荧光的信号生成，该检测方法实现了显著的灵敏度（检测限：8.1 x 10^4 拷贝/μL）和特异性，具有广泛的线性检测范围（10^5 至 10^10 拷贝/μL）。其稳健的设计确保了重现性（相对标准偏差：9.63%）和高突变耐受性，即使在突变序列过量10,000倍的情况下也能准确检测ASFV DNA。该平台依赖Fe3O4@SiO2磁性纳米颗粒，实现了经济高效且多功能的生物共轭，扩展了其在各种病原体和复杂生物基质中的适用性。虽然CIMNE-CRISPR在ASFV检测中表现出色，但未来的方向包括提高对低病毒载量的灵敏度、实现多重检测以及集成便携式检测系统以实现实时、即时诊断。通过解决纳米颗粒-Cas复合物在储存和运输过程中的稳定性等挑战，该系统有望重新定义基于CRISPR的诊断方法，应用于农业、环境和人畜共患病领域。
原文信息：
Pal, T., Liu, Z., Chen, J., CIMNE-CRISPR: A Novel Amplification-FreeDiagnostic for Rapid Early Detection of African Swine Fever Virus, Biosensors and Bioelectronics,https://doi.org/10.1016/j.bios.2025.117154
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