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摘要

猪圆环病毒（porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科圆环病毒属成员，1974年Tischer在PK-15细胞中发现，PCV病毒粒子为二十面体对称结构，含有单股负链环状DNA相对分子质量为5.8。

最初，PCV只包括PCV1和PCV2 2个基因型，但在2016年10月，美国Kansas州立大学的R.Palinski等和加州大学San Francisco分校T.G.Phan等几乎在同一时间报道了1个新的PCV基因型PCV3；

2019年在中国湖南首次发现了猪圆环病毒4型（PCV4）。其中，PCV1一般认为无致病性，PCV2与猪的很多疾病有关，以仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）最为常见，给养殖业造成了巨大的经济损失。尽管PCV3分布广泛，但其致病性仍存在争议。

同时，PCV4具有典型的PCV特征，例如保守的九核苷酸发夹结构和编码PCV主要蛋白Cap的开放阅读框ORF2（图1）。

鉴于PCV的历史影响，需进一步研究以确定PCV4是否对养猪业构成潜在威胁。

Cap蛋白作为PCV的主要结构蛋白，其在对PCV的监测与抗病毒方面具有广阔的应用前景。

本研究从采自贵州省疑似PMWS的病料中成功扩增克隆1株PCV4的ORF2基因全长，并对其基因组进行序列测定和比较分析，旨在了解该毒株的分子生物学特征。

2.1 PCV4-GZ1-Cap基因PCR扩增结果

取PCR反应结束后的产物10 µL于1%琼脂糖凝胶进行电泳检测，电泳结束后用凝胶成像系统进行观察，结果显示：可见与预期大小相符的片段（图2）。

同时，将PCR产物胶回收阳性产物并送至生工生物工程（上海）股份有限公司进行DNA测序，获得PCV4-GZ1-Cap基因系列。

图2   PCR扩增结果

A：检测产物；B：阳性对照；C：阴性对照；M：DL2000 DNA Marker。

2.2 PCV4-GZ1-Cap基因的核苷酸序列分析

与目前国内外报道的毒株比较，PCV4-GZ1-Cap核苷酸序列全长与HNU-AHZ-2019（MN162710）、JXYC-2021（MW988111.1）、SC-GA2022ABTC（OP497960.1）等毒株一致，均为687 bp，与大多数PCV2 Cap核苷酸序列全长（705 bp）相差18 bp；

发现PCV4-GZ1-Cap核苷酸序列全长与XOR株（NC_038385）的Cap核苷酸序列（全长为714 bp）相差较大。

在ORF2基因的转录过程中，除XOR株的起始密码子和终止密码子所对应系列为ATG和TGA（即mRNA上的起始密码子为AUG，终止密码子为UGA）外，其他所比较的18株PCV4的ORF2的mRNA起始密码子和终止密码子对应的基因系列均分别为ATG和TAA（即mRNA上的起始密码子为AUG，终止密码子为UAA）。

2.3 PCV4-GZ1-Cap的核苷酸及氨基酸同源性分析

将PCV4-GZ1-Cap ORF2与收集的其他19株PCV4的ORF2用DNAStar中的MegAlin模块进行核苷酸和氨基酸比对。

结果显示，PCV4-GZ1株的ORF2核苷酸与XOR株的同源性仅为37.3%，其他毒株均在96.2%～99.1%，其中PCV4-GZ1与2021年4月21日中国江西报道的JXYC-202（MW988111.1）同源性最大，为99.1%，与美国马里兰州所报道的KF283L/UPM/MY002株（OP588910）同源性最低，为96.2%；所编码的氨基酸的相似性为89.5%～96.1%。

PCV4-GZ1-Cap ORF2与国内报道的15株毒株比对，核苷酸同源性为91.2%～97.4%，所编码的氨基酸相似性为90.2%～96.6%；与国内报道的3株毒株比对，核苷酸同源性为96.2%～97.7%，所编码的氨基酸相似性为89.5%～93.0%。

2.4 PCV4-GZ1-Cap基因构建的系统进化树分析

将所收集的19株PCV4毒株的ORF2基因核苷酸序列应用MEGA 11.0软件构建系统进化树，以更好地研究PCV4-GZ1-Cap的遗传学特性。

结果如图3所示，可大体将该进化树分为3簇：本试验中的PCV4-GZ1-Cap毒株与Hebei1（MW262973.1）、Hebei-Fox1（MW262984.1）、PCV4/Hebei/67/2019（MT995847.1）、JXYC-2021（MW988111.1）、AH-2022（OP221238.1）、PCV4/GX2020/FCG49（MT311 854.1）、JSYZ1803-27（MT769265.1）和SCGA-Cat（OQ734983.1）等9株处于同一簇；

HNU-AHZ-2019（MN162710.1）、SC-GA2022ABTC（OP497960.1）、FJ2020001（MW238796.1）、PCV4/CN/NM3/2017（MT882412.1）、PCV4/KF283L /UPM/MY002（OP588910.1）、E115（MT882344.1）、Thailand/2019/19RBR246（ON854861.1）、PCVVIRES NX01 G28（MK948416.1）和YH150（OQ939948.1）等9株处于同一簇；

SCABTC-Dog2022（OP948894.1）单成一簇。

本试验测序所获得PCV4-GZ1株与JXYC-2021遗传距离最近。

本试验收集2019—2023年来自不同省份（国家/地区）的19株PCV4系列，但系统进化树并未体现出空间和时间上的规律，表明PCV4在全世界的分布无地域性。

图3   使用NJ算法构建的PCV4 Cap基因核苷酸序列进化树

●：国外毒株；□：国内毒株；▅：试验毒株。

2.5 PCV4-GZ1-Cap ORF2编码的蛋白预测分析

将19株PCV4毒株的ORF2基因核苷酸序列应用MEGA 11.0软件翻译成氨基酸系列，并进行比对分析。

结果显示ORF2编码的氨基酸易变异位点共10处：

在aa28处2株为甘氨酸（G1y, G），17株为精氨酸（Arg, R）；

在aa53处1株为半胱氨酸（Cys, C），3株为丙氨酸（Ala, A），15株为丝氨酸（Ser, S）；

在aa70处2株为谷氨酸（G1u, E），17株为赖氨酸（Lys, K）；

在aa82处1株为天冬氨酸（Asp, D），18株为天冬酰胺（Asn, N）；

在aa85处1株为甘氨酸（G1y, G），18株为丝氨酸（Ser, S）；

在aa94处1株为异亮氨酸（Ile, I），18株为精氨酸（Arg, R）；在aa138处1株为谷氨酰胺（Gln, Q），18株为组氨酸（His, H）；

在aa163处1株为精氨酸（Arg, R），18株为甘氨酸（G1y, G）；

在aa165处1株为异亮氨酸（Ile, I），18株为苏氨酸（Thr, T）；

在aa196处1株为甘氨酸（G1y, G），18株为丝氨酸（Ser, S）。

其中，本研究中的PCV4-GZ1株的ORF2基因系列第36位和43位均由G突变成T未引起其编码氨基酸的变化，但第281位由G突变成T，造成所编码的氨基酸由精氨酸（Arg, R）变成了异亮氨酸（Ile, I）；

第414位由C突变成A，造成所编码的氨基酸由组氨酸（His, H）变成谷氨酰胺（Gln, Q）。

这些结果表明PCV4 ORF2基因组小而精简多样，其复制方式灵活多变，可能容易受宿主影响而产生变异。

2.6 ORF2编码的Cap蛋白基本特性分析

运用分子生物学分析软件对PCV4 GZ1株的ORF2所编码Cap蛋白进行预测。

ExPASy的ProtParam tool对PCV4-GZ1的ORF2推导的氨基酸病毒Cap蛋白的基本特性，结果显示分子质量为25 027.01 u；

蛋白质带净电荷的原因其表面离子化侧链的存在，这些侧链均可以滴定，每个蛋白都存在1个使它表面净电荷为零的pH值，等电点为6.9，带负电荷残基的总数（Asp + Glu）为20，带正电残基的总数（Arg + Lys）为19；脂肪族指数为97.74。

运用分子生物学分析软件SignalP对PCV4-GZ1的ORF2推导的氨基酸病毒Cap蛋白的信号肽（Signal peptide）进行预测，结果表明没有切割位点，即无信号肽，推测PCV4-GZ1的ORF2推导Cap蛋白可能不是分泌性蛋白。

由于含有跨膜域的蛋白质或许是定位于膜的蛋白或离子通道蛋白，也可能是作为膜受体而起作用。

应用在线软件TMHMM对PCV4-GZ1-Cap跨膜域进行预测，结果显示输入片段有228个氨基酸，预测到的TMHs跨膜螺旋数为0，表明该预测片段无跨膜蛋白或者有信号肽（如果这个数字大于18，很可能是跨膜蛋白或者有信号肽)。

同时，蛋白前60个氨基酸中跨膜氨基酸的预期数值0.181 44，进一步预测了跨膜螺旋的N端不是1个信号肽。

结果表明没有切割位点，推测PCV4-GZ1的ORF2推导Cap蛋白可能不是分泌性蛋白。

应用在线软件ExPASy的ProtScale工具对PCV4-GZ1-Cap氨基酸序列的疏水性给予预测，结果显示PCV4-GZ1-Cap整体表现出较强的疏水性，表明PCV4 GZ1株的ORF2所编码Cap蛋白为疏水性蛋白。

关于PCV的致病性研究，PCV1于1974年首次被检测到，是一种细胞培养污染物，对猪没有致病性；

PCV2的致病性已得到充分证实，PCV2于1998年被Allan发现，它与PCV1结构相似，但二者同源性小于80%，PCV2目前仍是全球传播的频发病原，多系统衰竭症、肠炎、肺炎和生殖障碍等症状是感染PCV2后的猪只常表现出来的症状，这些疾病被统称为猪圆环病毒病（PCVD）或猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）；

在患有呼吸道疾病和腹泻的猪中，PCV3的检出率和病毒滴度相对较高，表明PCV3与这些临床疾病的发生存在一定的相关性，PCV3也可以在健康动物中检测到，而PCV4可以被单独检测，也可以同时在感染PRRSV或PCV2的猪中检测到，大多数受试猪表现出严重的临床症状，包括呼吸道疾病、肠炎、猪皮炎和肾病综合征。

本试验中，在患有皮炎和疑似PMWS的病死仔猪中检测到PCV4，这与Zhang等的研究相吻合。

本研究从疑似PMWS的病料中，应用PCR方法成功进行了PCV4 Cap基因组扩增和测序。所获得的PCV4 Cap核苷酸序列全长为687 bp；

核苷酸的同源性与参考毒株均在96.2%～99.1%，所编码的氨基酸的相似性为89.5%～96.1%；

ORF2编码的氨基酸易变异位点共23个，且变异位点主要集中于115位之后，进一步表明PCV4 ORF2基因组小而精简，其复制方式灵活多变，可能容易受宿主影响而产生变异。

通过节约遗传资源，以小量重复的蛋白质包裹大量遗传信息，确保其在环境中得以生存，也正是这种基因的精密设计，使病毒能够在微观世界中生存并延续其生命。

本试验所收集的19株PCV4 Cap基因系统进化树未体现出空间和时间上的规律，表明PCV4在全世界的分布无地域性。

通过对PCV4-GZ1的ORF2推导出氨基酸病毒Cap蛋白的基本特性，结果显示分子质量为25 027.01 u，等电点为6.9。

信号肽在蛋白质分泌中起着重要作用，决定了蛋白在细胞内的分布。

宿主细胞中的外源蛋白，例如大肠杆菌，大多以不溶性细胞内包涵体的形式表达，少数则以细胞外分泌物的形式表达。

信号肽用于引导外源蛋白定位和分泌到细胞内的特定位置，从而增加溶解度，避免包涵体复性引起的困难。

通过预测，PCV4-GZ1的ORF2推导的氨基酸病毒Cap蛋白无信号肽也不存在跨膜域，推测Cap蛋白不是分泌蛋白，它是由游离的核糖体合成，进入胞质溶胶的蛋白质，在病毒的生理过程中参与线粒体、细胞核、过氧化物酶体等的生化反应。

这些数据可为贵州地区的PCV4分子流行病学调查及科学防控提供依据。截至目前，PCV4的存在时间、感染率、流行情况及致病性并不明确，而Cap蛋白作为PCV的唯一结构蛋白，在病毒的感染与复制中起着至关重要的作用。

因此，对PCV4 Cap蛋白展开研究，对接下来PCV2、PCV3与PCV4的Cap蛋白之间是否可以提供交叉保护，通过PCV4 Cap基因的分析、流行病学调查以及蛋白的表达建立PCV4抗体水平的检测方法都具有重大意义。

同时，本试验未对该病料进行其他种类的PCV检测，课题组下一步的工作将围绕这一方向进行深入的研究。