研究背景
渍水胁迫下，植物缺氧导致无氧呼吸和能量产生减少，并且导致土壤毒素积累，对植物生存产生负面影响。在渍水胁迫下，根系中与糖酵解和发酵相关的特定基因被激活，而其他能量消耗途径被抑制，这些基因包括编码参与乙醇发酵的关键酶：丙酮酸脱羧酶（PDCs）和乙醇脱氢酶（ADHs）。ADH1过表达在渍水胁迫下调节糖酵解代谢途径，促进乙醛向乙醇的转化，从而提高耐渍性，而耐渍性的关键差异在于通过碳水化合物供应维持糖酵解增强的能力。花椒的肉质浅根对渍水胁迫敏感，研究花椒的代谢调节和根系适应性对提高其耐渍性和发酵途径激活的分子机制具有重要意义，通过RNA-seq确定了几个与糖酵解/糖异生、糖代谢相关的关键基因，其中就包括ZaADH1。
近期，发表在Plant Physiology and Biochemistry的研究论文“The conserved transcriptional regulation mechanism of ADH1 gene in Zanthoxylum armatum to waterlogging stress”通过RNA-seq鉴定出关键基因ZaADH1，并在拟南芥中进行异位表达实验，证明了ZaADH1基因在提高花椒耐渍性中起到重要作用。
研究结果
作者对11月龄的花椒苗分别进行渍水处理1、2、3、5天，随着渍水时间的延长，根系逐渐变暗（图1A）。渍水2、3、5天后，叶柄变软，呈明显下垂表型（图1B）。这些结果表明，根和茎对长期渍水胁迫都很敏感。
图1 对照组和渍水胁迫1、2、3、5天花椒根（A）和芽（B）的代表图。红色箭头指向发黑的根尖、主根和枯萎的芽。
作者对渍水胁迫0 h、12 h、1 d、3 d和5 d进行RNA-seq分析。相对于0 h组，12 h、1 d、3 d和5 d分别有934、631、989和784个上调DEGs（图2A）。为了确定响应胁迫的基因和重要的代谢途径，作者选择了在所有时间点均显著上调的基因（2048个）进行分析。C-means聚类分析将不同渍水阶段的DEGs分为4个集群（图2B），揭示了不同渍水胁迫下根样品中基因表达的变化，集群3、4早期高表达，集群1、2晚期高表达。GO分析表明，集群3 DEGs富集与碳水化合物分解代谢过程、核糖核苷酸生物合成过程、核糖磷酸生物合成、嘌呤核糖核苷酸生物合成过程和核苷二磷酸代谢过程相关的基因；集群4 DEGs富集与碳水化合物分解代谢过程、分解代谢过程、细胞碳水化合物代谢过程和有机物分解代谢过程相关的基因；集群1在信号转导和信号传递过程中富集；集群2没有显示出GO富集（图2C）。此外，对4个集群的基因进行KEGG分类（图2D），早期渍水诱导的3、4集群DEGs显著富集于糖酵解/糖异生途径相关基因，说明糖代谢在花椒早期渍水响应中起重要作用。
图2 渍水处理期间花椒转录组的时间动态。
作者进一步描述了每个DEGs参与碳水化合物代谢和碳水化合物信号转导的功能（图3A）。α-D-葡萄糖-1P是糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、戊糖和葡萄糖酸盐相互转化的枢纽化合物，参与糖酵解/糖异生的乙醇、麦芽糖、淀粉、糖原、海藻糖和蔗糖生物合成的几个基因被上调，在α-D-葡萄糖-1P到糖酵解的通路中，FBA和GAPC基因高表达（图3A、B）。qPCR结果表明，在渍水胁迫下的12 h、1 d、3 d和5 d，ZaADH1的表达水平提高（图3C），表明其与耐渍性相关。相较于对照组与渍水胁迫下的碳水化合物、ADH和PDC酶活存在显著差异（图3D）。渍水胁迫2 d后总糖、蔗糖和可溶性糖含量降低，3 d后海藻糖含量显著升高。尽管随着渍水时间的延长，碳水化合物逐渐减少，渍水胁迫1 d和2 d后，ADH酶和ADH相关物质保持了显著的高活性，这些结果表明，糖类化合物在花椒渍胁迫响应中起着关键作用。在α-D-葡萄糖-1P代谢为半乳糖的途径中，DIN10在半乳糖醇转化为蔗糖并进入淀粉和蔗糖代谢途径中发挥重要作用；在渍水胁迫早期（12 h和1 d），UGP2和SUS呈高表达，加速UDP葡萄糖转化为蔗糖。作者对糖酵解/糖异生、淀粉和蔗糖代谢、半乳糖代谢、戊糖和葡萄糖酸盐相互转化相关的关键DEGs进行了共表达网络分析，在各时期表达水平相对较高的基因中，ADH1和ALDH、SUS3、FBA6和BAM高度相关（图3E）。这些基因参与糖酵解/糖异生过程中α-D-葡萄糖-1P的转化，以及淀粉和蔗糖代谢途径。
图3 渍水胁迫下花椒根系碳水化合物代谢途径的转录响应。A.淀粉和蔗糖代谢（黄色）、半乳糖代谢（橙色）、糖酵解/糖异生（蓝色）、戊糖和葡萄糖酸盐相互转化（浅蓝色）。
4. 过表达ZaADH1增强转基因拟南芥耐渍能力
此外，qPCR实验结果表明，在正常条件下，OE株系的AtADH1表达量显著高于WT。且渍水胁迫12 h和1 d后，OE株系的ADH酶活性显著升高，AtADH1和AtPDC1显著下调。渍水胁迫3 d后，OE株系的ADH酶活显著降低，AtADH1和AtPDC1表达水平降低。说明，AtADH1和AtPDC1对渍水胁迫的响应较早（图4I、J）。
图4 ZaADH1过表达拟南芥株系在渍水胁迫下的表型观察。
作者对转基因拟南芥和花椒在不同渍水阶段的茎和根组织进行了比较转录组分析（图5A-D）。GO分析表明，在拟南芥和花椒中普遍上调的基因在有机酸代谢、碳水化合物分解代谢、细胞碳水化合物代谢和单循环代谢相关过程中富集；普遍下调的基因在氧化应激反应、化学反应、细胞碳水化合物代谢和碳水化合物衍生物代谢相关的过程中富集（图5E和F）。
图5 渍水胁迫下拟南芥和花椒的茎、根转录组的时间动态。
KEGG富集分析表明，拟南芥和花椒中普遍上调的基因在戊糖和葡萄糖酸盐相互转化途径中富集。相比之下，在这两个物种中常见下调的基因在植物激素信号转导、淀粉和蔗糖代谢、类黄酮生物合成等途径中富集（图6A和B）。在OE株系的茎和根中，与胁迫反应相关途径的基因水平明显高于花椒。上调和下调的基因都富集在淀粉和蔗糖代谢途径中。对这些通路中常见基因表达的进一步分析显示，AtATBFRUCT1（AT3G13790）在长期渍水胁迫下促进碳水化合物合成方面发挥了重要作用，而AT2G35840的下调则显著影响了这一通路（图6C）。这些结果表明，在渍水胁迫后期，AtATBFRUCT1的上调促进了碳水化合物的合成，满足了生长所需的能量。相反，渍水胁迫诱导的AT2G35840下调抑制了碳水化合物的形成，导致能量消耗（图6D）。这些物种特异性反应和碳水化合物代谢的独特调控，揭示了拟南芥和花椒在渍水胁迫下的适应策略和独特的分子机制。
图6 渍水胁迫下拟南芥和花椒代谢途径的比较分析。
总结与讨论
研究结果表明，ZaADH1过表达通过调节ADH酶、可溶性糖和海藻糖的代谢水平，促进糖酵解和碳水化合物代谢，从而响应渍水胁迫。在拟南芥中过表达ZaADH1增加了植株总面积和叶绿素含量，对渍水胁迫的抗性增强。拟南芥生理和过表达转录组分析表明，ZaADH1过表达系产生更多碳水化合物以满足能量需求，采用“静态”策略增加对涝渍胁迫的耐受性，这证实了ADH1对涝渍胁迫反应的保守性，可能是提高拟南芥涝渍耐受性的关键措施。
个人心得与感悟
本研究通过转录组学探究了渍水胁迫下ZaADH1下游的转录调控机制并结合生理代谢机制揭示了拟南芥和花椒在渍水胁迫下的适应策略和独特的分子机制。文章中提到，虽然ADH作为乙醇发酵控制点的作用已经得到确认，但ADH过表达对植物在渍水胁迫下存活的贡献似乎取决于物种，植物耐渍性的关键差异在于通过碳水化合物供应维持糖酵解增强的能力。这为我们挖掘小麦耐渍种质以及探究小麦在渍水胁迫下过表达ADH基因以探究下游转录调控机制和代谢水平的变化提供了研究思路。
https://doi.org/10.1016/j.plaphy.2024.109133
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