小麦叶锈病由小麦叶锈菌Puccinia triticina引起，是小麦中最常见且破坏性最大的疾病之一，严重时可导致高达50%的产量损失。小麦野生近缘种的广谱抗性基因对小麦抗病育种非常重要。前人研究发现，小麦-冰草（Agropyron cristatum）易位系2PT5对中国不同地区的50个叶锈病小种表现出广谱抗性，叶锈病抗性基因定位在2PL染色体片段的0.66–0.86分段。然而，外缘染色体片段与小麦基因组间缺乏重组，不利于抗性基因的利用。鉴于现有小麦品种中广谱叶锈抗性基因的匮乏，研究并克隆新的广谱抗叶锈病基因，以在小麦育种中优化其利用，对于培育抗病品种至关重要。
2024年9月6日，中国农业科学院作物科学研究所李立会老师课题组的徐世锐师姐和吉夏洁师姐在Plant Communications期刊发表了题为“AcRLK2P-1, an LRR receptor protein kinase gene from Agropyron cristatum, confers leaf rust resistance in wheat”的文章。作者结合PacBio Isoform测序技术和RNA测序（RNA-seq）克隆了小麦-冰草2PL易位片段中的叶锈抗性基因AcRLK2P-1，并通过EMS突变分析和转基因实验进一步验证了AcRLK2P-1的功能。
作者首先对接种前后的小麦-冰草抗病易位系2PT5及其易感亲本普通小麦Fukuhokomugi（以下简称Fukuho）进行了RNA测序，分析了2PT5在叶锈感染过程中的生理过程及差异表达的抗性基因（图1A）。作者通过分析2PT5与Fukuho接菌前后的差异表达基因、2PT5自身上调基因，并进行功能注释后，锁定了11个与抗病有关的基因。同时，作者通过使用多种易位系的群体遗传分析，成功将抗病位点缩小到了9.2 Mb片段。接着，作者分析了这11个基因的表达水平，并结合定位区域分析，选择了接种后表达显著上调且表达水平最高的AcRLK2P-1作为候选基因进行进一步分析。AcRLK2P-1编码一个富含亮氨酸重复的受体蛋白激酶，包含跨膜结构域（TM）、亮氨酸重复序列（LRR）和丝氨酸/苏氨酸激酶结构域（S-TKc）（图1C）。
为验证AcRLK2P-1是否参与叶锈抗性，作者对EMS诱变产生的6个M2代感病突变体家系中的AcRLK2P-1基因组DNA序列进行了扩增和测序（图1D）。在这些感病突变体中，5个存在SNP突变，其中4个导致氨基酸替换和提前终止密码子。突变位点Mut57（g.488T>A，p.F163Y）、Mut66（g.2824C>A，p.S349*）、Mut159（g.3584G>A，p.A547T）和Mut172（g.2902G>A，p.S376N）位于外显子中，而突变位点Mut81（g.1556C>T）位于内含子中（图1E）。此外，在感病突变体Mut158的AcRLK2P-1基因组DNA序列中未检测到序列变化，可能存在与感病相关的二次突变。
为验证AcRLK2P-1是否足以赋予叶锈抗性，作者分别通过玉米泛素（Ubi）启动子驱动的proUbi:AcRLK2P-1和本地启动子驱动的pAcRLK2P-1:AcRLK2P-1，采用农杆菌介导的转化方法将其导入感病小麦品种Fielder。在T0代所有转基因阳性植株均表现抗病，而阴性T0植株和Fielder则表现感病。通过自交获得的T1代植株对叶锈菌表现出增强的抗性（图1F）。在对T1转基因植株接种10个其他叶锈菌系后，结果表明与Fielder相比，T1转基因植株对其中的8个叶锈菌系表现出增强的抗性（图1G）。这一发现表明AcRLK2P-1在2PT5的叶锈抗性中起重要作用，但2PT5的广谱抗性不仅仅归因于AcRLK2P-1的功能。此外，三株独立的pAcRLK2P-1:AcRLK2P-1转基因家系的植株对叶锈菌系TGT表现高抗（图1H）。
qPCR分析表明，2PT5在接种叶锈菌系THT后，AcRLK2P-1在叶片和茎部组织中显著上调（图1I）。AcRLK2P-1基因在2PT5中的表达显著上调，且在接种叶锈菌系THT后24小时达到峰值（图1J）。AcRLK2P-1蛋白定位于细胞膜上（图1K）。
随后，作者在AcRLK2P-1转基因植株和Fielder中调查了五个PR基因的表达。与Fielder相比，AcRLK2P-1转基因植株在接种后表现出显著上调的PR基因表达，表明AcRLK2P-1对PR基因的表达有调控作用。此外，接种后，2PT5相比Fukuho表现出显著上调的PR基因表达。因此，2PT5在接种叶锈菌系THT后，病理相关基因的表达显著上调。
AcRLK2P-1蛋白及其禾本科作物中的同源蛋白的系统进化分析显示，AcRLK2P-1蛋白与普通小麦、乌拉尔图小麦和节节麦的同源蛋白共享一个进化分支。此外，大麦的同源蛋白位于一个更接近的分支，表明它们的亲缘关系更近。对AcRLK2P-1与小麦A、B、D基因组、乌拉尔图小麦、节节麦和大麦的氨基酸序列进行比较。不同物种中的同源蛋白在LRR结构域中表现出相对保守性，在S-TKc结构域的N端表现出高度保守性。将AcRLK2P-1基因的全长序列与小麦的同源基因TraesCS2A02G563900、TraesCS2B02G625200和TraesCS2D02G573700进行比较。AcRLK2P-1基因的全长序列分别与TraesCS2A02G563900、TraesCS2B02G625200和TraesCS2D02G573700的相似度为77.86%、86.23%和85.61%。
总结：小麦野生近缘种的广谱抗性基因对小麦抗病育种非常重要。激酶在小麦抗病育种中的植物免疫反应中起着重要作用。在本研究中，作者成功克隆了第一个来自冰草的抗病基因—抗叶锈病基因AcRLK2P-1，该基因编码含有激酶和LRR结构域的蛋白。这一发现扩展了我们对LRR-RLKs的理解，并进一步确认了LRR结构域在植物抗病机制中的重要性。由于栽培小麦中缺乏这种外源广谱免疫特性，小麦-冰草的小片段易位系对叶锈表现出广谱抗性，可以在小麦抗病育种中发挥重要作用。
