Nat. Commun. | 揭示不同癌症类型中髓系细胞的多样性和作用

今天为大家介绍的是来自云南大学医学院的肖春杰团队的一篇论文。髓系细胞是免疫系统的重要组成部分，在协调免疫反应中具有关键功能。理解它们在肿瘤微环境中的作用及其与肿瘤浸润淋巴细胞的相互作用，在各种癌症类型中，特别是在癌症免疫疗法方面，提出了巨大的挑战。在此，作者通过对八种不同类型癌症的单细胞转录组学进行泛癌分析，探索了肿瘤浸润髓系细胞（TIMs）。本研究共涉及129名患者的192个肿瘤样本。通过检查不同癌症类型中TIMs的基因表达模式和转录活动，作者发现了TIMs在免疫治疗前后数量和动力学行为的显著变化。作者还识别了免疫治疗中的特定细胞间相互作用目标，对治疗反应至关重要的独特和共享调控特征以及与生存结果相关的TIMs。总体而言，作者的研究揭示了TIMs的异质性，并改善了对肿瘤免疫疗法背景下组织特异性和癌症特异性髓系亚群的理解。

免疫检查点阻断（ICB）免疫治疗的发展标志着癌症治疗领域的重大突破，近年来取得了令人鼓舞的临床成果。虽然T淋巴细胞一直是ICB研究的主要焦点，但髓系细胞在肿瘤微环境（TME）中的丰度和多样性尽管显著，却未受到同等的关注。对TIMs的研究兴趣日益增长，但它们在TME中的影响及其对ICB反应的影响仍然未完全理解。目前，髓系细胞大致可分为包括巨噬细胞、单核细胞、经典树突状细胞（cDCs）和浆细胞样树突状细胞（pDCs）等亚群。然而，这种传统分类往往过于简化，无法全面捕捉TIMs的异质性。实际上，在TME中已经识别出许多髓系细胞的亚类别，例如肿瘤相关巨噬细胞（TAMs），它们传统上分为M1型巨噬细胞（通常抑制肿瘤生长）和M2型巨噬细胞（倾向于促进肿瘤发生）。广义分类未能捕捉到TIMs的全部复杂性。因此，现代单细胞研究更倾向于将它们的功能状态视为一种异质性模式。

为评估不同癌症中TIM的异质性，作者对来自129名患者的肿瘤样本进行了scRNA-seq分析，这些样本涵盖了八种不同类型的癌症：基底细胞癌（BCC）、乳腺癌、肾透明细胞癌（ccRCC）、结直肠癌（CRC）、肝细胞癌（HCC）、头颈部鳞状细胞癌（HNSCC）、肝内胆管癌（iCCA）和黑色素瘤。

图1：泛癌髓系图谱的人口统计学概述

图1a展示了五种癌症类型（BCC、ccRCC、CRC、HNSCC和黑色素瘤）有关于治疗反应状态的临床信息。在八种癌症类型中，作者识别出了12种巨噬细胞和单核细胞亚型、四种cDC亚型以及一组肥大细胞（图1b, c）。作者主要通过FOLR2和APOE的表达区分了三种巨噬细胞亚型。基于LILRA4、GZMB和IL3RA的独特表达，将两个cDC簇清晰地与浆细胞样树突状细胞（pDC）簇区分开来。HLA-DQA1在两个cDC簇中均有表达，但在cDC_CLEC9A簇中的平均表达更高，肥大细胞特异性标志物也仅在这一细胞群体中表达。

这八种癌症类型的样本根据其治疗状态进行了分类，包括治疗前（Pre）、治疗后（Post）、治疗无反应者（NR）和治疗反应者（R）。如图1d, e所示，作者比较了每对分层组之间的细胞类型分布，以评估任何差异。在治疗前组，cDC (CD1C)是iCCA和乳腺癌中的主要细胞类型，Macro_NLRP3在BCC和ccRCC中占最大比例。在治疗后组，pDC_LILRA4成为BCC和黑色素瘤中的主要细胞类型，而Macro_LYVE1在HCC和iCCA中占主导地位。几种癌症类型在治疗后Macro_ISG15和Mono_INHBA的比例显著下降，而Macro_FOLR2 − APOE +、Macro_APOC1 + IFI27 +、Macro_LYVE1和Macro_OLFML3在治疗后组显著增加。相较而言，在许多癌症类型中R组的Macro_NLRP3和Mono_CD14显著增加，而在NR组中没有明显的比例变化。

肿瘤微环境是一个由多种细胞类型组成的复杂环境，这些细胞类型不断发生动态变化。为了研究TIMs的时间变化和发育模式，作者通过检查每种细胞类型的伪时间轨迹，在泛癌层面进行了其动力学特征的全面分析。

图2：跨TIMs的伪时间转换

在免疫治疗后，特定细胞类型的平均伪时间发生了显著变化。如图2a, b所示，Mono_CD14、Macro_NLRP3、Mono_CD16和Macro_IER3的平均伪时间显著缩短，表明这些细胞在治疗后处于较少分化状态。相反，pDC_LILRA4在免疫治疗后显示出显著的轨迹分化延迟同时，cDC (CD1C)、cDC_LAMP3、肥大细胞、Macro_LYVE1和Macro_FOLR2 + APOE+在治疗前后样本之间的平均伪时间变化较小。Mono_CD14、Macro_IER3、Macro_NLRP3、Macro_ISG15和cDC_CLEC9A在NR组中相比R组表现出显著的伪时间延迟，而肥大细胞、Macro_IFI27和Macro_OLFML3在这些组中没有检测到显著的动力学差异（图2b, c）。有趣的是，作者在R组与NR组之间观察到了更多的细胞类型的大动力学变化，而在治疗前与治疗后组之间的变化较少，表明在不同疾病状态下可能存在从稳态到非稳态分化的潜在过渡差异。

作者的下一个目标是阐明分层疾病队列中的主要生物学状态。为此，作者根据其动力学状态对细胞进行分类，并建立了这些聚类动力学特征中的差异表达基因与分子标志数据库（MSigDB）中的标志基因集之间的相关性。如图2c, d所示，作者观察到促炎或抗炎信号的显著分支。在R组的巨噬细胞和单核细胞（Macro/Mono）群体中，大多数伪时间状态显示促炎路径的下调，如IFN-α/γ反应、通过NF-κB的TNF信号传导和氧化磷酸化，表明存在抗炎信号环境。然而，状态3显示TNF信号的上调，表明少数细胞仍然促进促炎信号。相反，在Macro/Mono群体的NR组中，包括mTORC1信号升高的细胞在内的大多数细胞处于促炎状态（状态3）。

作者随后分析了基因调控网络，以识别R组和NR组中TIMs内的活性调控元件（REs）。通过评估各细胞类型中转录因子（TFs）的转录活性，作者测量了不同癌症类型和反应状态下TIMs之间的相关性。

图3：细胞类型特异性调控活动情形

如图3a所示，来自相同癌症并表现出相同反应状态的细胞类型聚类在一起。作者还观察到每个R组和NR组与其各自癌症类型之间的紧密关系，这表明REs在与免疫治疗反应相关的TIMs中的高度癌症特异性。然后，图3b确定了导致这种聚类现象的TF模块。值得注意的是，在对CRC有反应的患者中，Macro_FOLR2 + APOE +、Macro_FOLR2 + APOE-、Macro_APOC1 + IFI27 +、cDC(CD1C)、Macro_OLFML3和cDC_CLEC9A中观察到了YBX1活性的增加，而在对CRC无反应的患者中，Mono_CD14、Macro_NLRP3、Mono_INHBA、Macro_OLFML3和Macro_ISG15中观察到了BCL3活性的增加。在R组中，MAFB活性在各类肿瘤浸润免疫细胞类别（包括Macro/Mono、DC和肥大细胞类别）中均持续降低，而在NR组中则没有显著变化（图3c）。此外，在Macro/Mono和DC类别中，促炎性TF JUNB在R组中的活性低于NR组（图3d）。

图4：反应组中不同细胞类型的细胞间相互作用模式

TME内复杂的细胞间相互作用不仅涉及TIMs，还涉及T细胞等其他免疫细胞群体。作者利用相同的样本集合检查了TIMs之间的相互作用、TIMs与CD4/CD8 T细胞之间的相互作用（图4a, b）以及TIMs与CD4/CD8 T细胞之间的相互作用（图4c, d）。具体来说，作者分析了来自治疗后样本的272,017个T细胞，并根据其独特的分子特征注释了12种CD4 T细胞亚型和15种CD8 T细胞亚型。

随后，作者研究了TIMs和特定CD4/CD8 T细胞亚群之间的相互作用。与TIMs之间的相互作用相比，较少的髓系细胞类型在TIMs与CD4/CD8 T细胞相互作用中表现出较大的倍数变化（绝对倍数变化>2）（图4c, d）。

为了全面了解免疫治疗背景下髓系细胞的转录调控特征，作者检查了在R组和NR组之间表现出差异细胞间相互作用的细胞类型中的调控模式，重点是高度互动TIMs的转录因子（TF）特征。

图5：高度相互作用的TIMs的靶向分析

作者观察到特定细胞类型中不同调控模块的差异表达。如图5a所示，调控模块簇c9仅由pDC_LILRA4表达，而c11和c3由cDC_LAMP3表达。此外，几个不同的TF特异性调控相关的TIM反应类别。对于其他细胞类型，R组和NR组调控表达之间的特征差异由一个或多个未聚类在调控模块中的TF标记。这些调控特征可能代表了负责相同TIM类型中R组和NR组细胞间相互作用变化的关键调控因子。除了调控模块外，作者还进一步确定了跨癌症类型在比较R组和NR组时同向调控的常见TFs（图5b）。

为了评估单个分层细胞类型对患者预后的影响，作者使用免疫治疗后队列进行了生存分析，包括IMvigor210尿路上皮癌（UC）、ccRCC和皮肤黑色素瘤（SKCM）。根据高度互动TIMs的特征标志物的表达对患者进行分类。图5c显示，cDC_LAMP3标志物的高表达与较低的生存率相关，而Macro_FOLR2 + APOE+、pDC_LILRA4和Macro-APOC1 + IFI27+标志物的高表达与改善的生存结果相关。这些标志物在预测免疫治疗后的生存结果方面具有潜力。然而，某些细胞类型，包括Mono_INHBA，在不同癌症类型中表现出相反的生存关系，强调了在生存结果方面观察到的癌症特异性和巨噬细胞异质性。

作者旨在开发一个专门设计用于预测ICB疗法反应的指数，该指数基于不同反应条件下每种细胞类型的富集途径以及每种癌症类型中这些条件下各细胞类型的比例。为了构建该指数，作者在MSigDB标志类别中进行了广泛的基因集合富集分析（GSEAs），涵盖了每个分类组中的所有细胞类型的不同癌症。这使得作者能够识别出每种细胞类型的癌症特异性和反应特异性标志物。如图5d所示，通过考虑细胞类型的癌症特异性比例和所识别标志物的富集分数，作者创建了一个治疗反应指数，在index = 0时清晰地区分了ICB反应者和不反应者。

FOLR2+巨噬细胞在肿瘤中的密度与乳腺癌和HCC患者的生存率相关。因此，作者观察到的Macro_FOLR2 + APOE+细胞及其与T细胞的相互作用具有显著意义。为了证实免疫治疗领域内细胞类型组成的变化，作者利用来自对ICB有反应者和不反应者的CRC患者样本进行了免疫荧光分析。图5e显示，有反应者中Macro_FOLR2 + APOE+细胞的丰度高于不反应者。作者还观察到Macro_FOLR2 + APOE+细胞附近存在CD4和CD8 T细胞。相反，作者在不反应者中未检测到任何Macro_FOLR2 + APOE+细胞，这表明这些细胞与治疗反应之间存在正相关关系。

TIMs在塑造TME、影响癌症进展和决定治疗反应中具有重要作用，但我们对其在不同癌症类型中的变异性和适应性以及对免疫治疗的影响了解不足。为了填补这一空白，作者汇集了大量肿瘤标本，全面探讨了各类癌症情景中TIMs的异质性，包括初治和治疗后的个体以及ICB治疗的反应者和不反应者。作者整合了多种癌症类型的表达谱，旨在揭示细胞变异和治疗反应的共同模式。通过详细分析，作者成功识别了广泛存在的细胞类型和基因表达模式，提出了多种癌症的潜在广谱治疗靶点。作者的研究强调了TIMs的显著异质性和在设计治疗策略时考虑髓系细胞群体中的癌症特异性修饰的必要性。

编译 | 于洲

审稿 | 曾全晨

Li W, Pan L, Hong W, et al. A single-cell pan-cancer analysis to show the variability of tumor-infiltrating myeloid cells in immune checkpoint blockade[J]. Nature Communications, 2024, 15(1): 6142.