Particulate organic matter as a functional soil component for persistent soi organic carbon
颗粒有机物作为持久性土壤有机碳的功能组分
土壤中的碳，是陆地最大的有机碳库，受植物碳输入、微生物活动和土壤母质之间的复杂联系进行调节。微生物是将植物碳转化为土壤有机碳的关键参与者，而土壤有机物和无机物的组成也会影响土壤微生物。本文采用同位素标记来研究土壤结构对凋落物有机质的影响。虽然质地较粗的土壤能够增强微生物活动和真菌生长在，研究表明，无论土壤结构怎样，闭塞的有机物团聚体和有机矿物结合体的形成主要发生在新鲜枯落物的表面。这两种机制—对有机物留存贡献最大的两个过程—直接发生在植物-土壤界面，其中，凋落物表面是土壤碳留存的关键。我们扩展了植物凋落物的概念，即颗粒有机质，从仅仅是一种容易获得和不稳定的碳基质，到直接决定土壤碳留存的功能组分。
关键词：碳库、粘土矿物、气候效应、森林类型、土壤有机质
由于持续植物碳源输入（C），土壤是陆地上最大的碳库。因此，这部分碳库在全球碳循环过程中扮演者关键的角色。微生物分解是植物碳源（OM）转换和促进土壤有机质（SOM）形成的关键过程。因此，微生物的丰度和活性决定了碳从早期植物残体转换到持久的土壤有机质的途径。反过来微生物又受到土壤环境的影响，其中生物、物理、化学因素决定了微生物的生长和活动。
土壤生物地球化学功能的一个主要因素是固体的三维排列。土壤的物理结构决定了孔隙度，影响气体（例如，二氧化碳和氧气）和水的运动与生物可利用性。土壤含水量的差异可以形成适合某些微生物类群的生态位，这些是由孔隙大小决定的。孔隙的大小还控制着微生物与其能量和营养素来源之间的关系—凋落物。可以预测土壤结构对微生物群落功能的影响，例如，通过有效氧，碳周转。
在过去的几十年里，越来越多的证据表明，与依赖于土壤聚集和矿物表面有效活性的土壤结构驱动机制相比，固有的化学稳定性对土壤有机碳的留存并没有那么重要。土壤碳主要储存在两个碳库中：颗粒有机碳（POM；主要来自植物的颗粒有机残留物）和矿质有机碳（MAOM；附着在矿物表面的有机质）。诸如有机质（OM）粘附到矿物表面的能力，或微生物对基质的有效利用等物理机制，有助于更好地理解土壤中有机质的循环和留存。土壤碳的留存受到小环境的调控，其中微生物将植物碳源转换为SOM。植物凋落物基质，微生物和土壤矿物表面之间的生物地球化学功能需要整体考虑化学，物理和生物因素。
在这里我们采用了系统的方法，通过研究物理土壤质地如何调控凋落物碳源的途径，即经由微生物将最初的植物枯落物转换为更稳定的SOM库（μm-mm）。为了探究微生物-矿物质相互作用相关过程，在95天的微观实验中，我们在两种不同质地的土壤上培养13C标记的凋落物。除了监测所产生的CO2以及凋落物碳源释放的13 CO2之外，我们将微宇宙分为三个深度增量，在这个过程中所伴随的POM和MAOM中SOM化学成分的变化，并评估微生物群落结构和微生物代谢过程。在这个过程中，凋落物碳源13 C被微生物用来合成磷脂脂肪酸（PLFA）。首次直接使用纳米级二次离子质谱（NanoSIMS）来研究完整的植物残体（POM），微生物和土壤矿物质之间的生物地球化学联系。本研究目的是定量评估微生物凋落物分解与形成持久的土壤碳库-团聚体之间的相互作用，以及微生物C与矿物表面之间的联系。研究表明，土壤质地控制微生物活动以及真菌的生长，这个过程中，由于枯落物的存在，相对于质地较粗的土壤，质地较细的土壤中所释放的CO2和真菌的丰度较高。PLFA谱进一步证明真菌主要消耗凋落物，并将其转化为生物量。在质地较粗的土壤中，真菌菌丝的扩张使得凋落物碳源在深层累积。真菌不仅仅有助于凋落物分解，而且有助于有机质的转移。这进一步表明来源于凋落物的碳C在更深的土层中累累积。结果表明，颗粒有机碳表面不仅微生物活动旺盛，而且不论土壤质地如何，有利于矿质有机碳凋落物碳源的形成，以及有利于调控有机质留存过程。
1.凋落物分解与原始土壤碳激发：
本研究通过监测土壤CO2排放研究土壤质地以及凋落物输入（enriched in 13C, δ13C= 2129±82‰V-PDB）如何影响土壤异养呼吸。通过分析13CO2，我们能够区分CO2来自原生土壤的有机碳还是来自输入的凋落物的有机碳。在质地较粗的土壤中，总呼吸量（89.4 mg CO2-C g-1 Cbulk）和凋落物产生的净CO2（40.4 mg CO2-C g-1 Cbulk）显著高于质地较细的土壤（55.3 mg CO2-C g-1 Cbulk和24.6 mg CO2-C g-1 Cbulk，P < 0.001，t =-7.512和t=-6.593;两者的df= 8，图1）。而在两种不同质地的土壤中，来源于凋落物产生的CO2占总呼吸的30%，在质地较粗的土壤中，因凋落物输入产生的碳激发效应较高（图1b和d），在质地较粗的原始土壤中净释放量为23.3 mg CO2-C g-1 Cbulk而在质地较细的原始土壤中净释放量为10.8 mg CO2-C g-1 Cbulk。
图1质地较粗以及质地较细的土壤中累计的异养呼吸。在95天的实验中质地较粗土壤（a/b）和质地较细土壤（c/d）呼吸所释放的CO2。右图显示两种不同质地土壤中总的激发效应以及质地较粗土壤中总呼吸产生的CO2（b）以及质地较细土壤中总呼吸产生CO2（d）。本研究通过标记源于CO2的C来直接研究过程水平机制。星号表示两种质地之间差异显著（***P < 0.001，****P < 0.0001）。采用非配对双侧t检验分析统计学显著性。
2. 颗粒以及矿质有机碳中凋落物碳比例：
本研究根据土壤粒径以及密度对两种质地的土壤进行分级，并评估两种质地土壤中凋落物对土壤稳定碳库的贡献。两种结构土壤中原始土壤的C含量的碳分布相似。两种质地土壤中主要是MAOC。研究表明质地较粗的土壤中团聚体中的凋落物碳含量显著较高（oPOM; 71.1 mgC g-1 Cbulk，而质地较细的土壤中为36.8 mgC g-1 Cbulk，P= 0.007，t=-5.03，df= 4），MAOM的含量略高（质地较粗糙的土壤中为101.3 mgC g-1 Cbulk，质地较细的土壤中为48.8 mgC g-1 Cbulk，P= 0.08，W= 0；图2b）。尽管统计意义上不显著，但是粗壤中较高的凋落物碳转换为oPOM和MAOM的这种趋势随深度增加至中心层时进一步下降（两种情况下P= 0.06，t分别为-2.66和-2.60；两种情况下df均为4）。
图2 土壤碳和凋落物碳在有机碳中的分布。粗壤和细壤中游离的颗粒有机质（fPOM）、闭塞POM（oPOM, oPOMsmall ）以及矿质有机质（MAOM）
3. 新鲜凋落物纳入土壤团聚体结构：
使用13 C固态核磁共振光谱（NMR）分析OM的化学组成。碳水化合物（O/N烷基C）明显地主导了所有fPOM的NMR光谱（图3），并且两种质地的oPOM中也检测到了相似的化学组成。在oPOM中，添加的凋落物诱导O/N烷基C区域的相对强度从约50%增加到70%（补充表1），证明多糖（主要是纤维素和半纤维素）占主导地位。根据分子混合模型结果，碳水化合物相对增加（粗质地土壤中+26%，细质地土壤中+20%），同时oPOM组分中木质素相对减少（粗质地土壤中-12%，细质地土壤中-10%）（补充表2）。相较于对照组，oPOM折射率降低也能证明凋落物有机C属于团聚体结构（补充表1）。
补充表1. 粗壤和细壤通过13C CP-MAS NMR光谱物理分级后颗粒有机质相对化学组成和烷基C/N比。
补充表2. 粗壤和细壤中应用13 C CP-MAS NMR光谱分子混合模型测得每个颗粒OM测得颗粒有机质碳水化合物，蛋白质，木质素，脂质和羰基化合物的相对量。
图3颗粒有机质化学组成差异。固态13 C CP-MAS NMR光谱显示了粗壤和细壤（黑色对照样品）中游离颗粒有机物（fPOM）和闭塞POM（oPOM，oPOM small）的化学组成。化学位移区域代表以下官能团：0-45 ppm（烷基C）、45-110 ppm（O/N烷基C）、110-160 ppm（芳香族C）和160-220 ppm（羧基C）。凋落物fPOM（两种质地）、凋落物oPOM（两种质地）、以及细壤中oPOMsmall有n=3个独立的重复。其余样品，n= 1。
4. 真菌对凋落物添加的反应最强：
通过测定微生物来源的PLFA，研究了添加凋落物对不同质地间微生物群落结构的影响。添加凋落物使得粗壤（61 nmol g-1 mg土壤C-1，P= 0.07，t=-2.40，df= 4）和细壤（76 nmol g-1 mg soil C-1, P= 0.10, t=-2.15, df= 4）上层总的PLEA量略微增加，而中层和底层的PLFA总量与对照组相近（图4a和b）。虽然土壤质地的差异对整体群落结构没有影响，但在真菌生物标志物中检测到对凋落物添加的强烈反应。真菌标记物的增加在粗壤的顶层特别明显，其中真菌丰度增加了5.4倍（P=0.01，t=-4.11，df= 4），而细壤中的真菌丰度增加了2.6倍（P=0.15，t=-1.75，df= 4）。与其他观察到的微生物组相反，粗壤中层真菌标记物增加（2.1 nmol g-1 mg soil C-1，对照组为0.4 nmol g-1 mg soil C-1，P= 0.02，t=-3.81，df= 4；图4c），而在细壤中，各层中没有相应的增加（图4d）。
图4 微生物的群落结构和功能。磷脂脂肪酸（PLFA）的总丰度以nmol C-FA g-1 mg-1 Cbulk（平均值，SD显示误差棒，n =3个独立重复）为单位，在具有（a）较粗和（B）较细质地的土壤中，分为（c）粗质地和（d）细质地土壤中的四个微生物亚群。由点和星号表（*P < 0.1，*P < 0.05）表示窝处理和对照之间的差异，并且小写字母表示顶层、中层和底层之间的差异显著（P < 0.05）。对照组显示为阴影。使用非配对双侧t检验分析窝处理之间的统计学显著性，并使用单因素ANOVA和Tukey HSD作为事后检验分析深度之间的差异。
当考虑观察组中凋落物13 C的脂肪酸相对于样品中富集FA总量的比例时，质地和深度都没有影响（图5a）。这证实了PLFA分析期间检测到的群落结构一致。当考虑每个微生物组中13C富集的FAs与未标记的FA的比例时，真菌标记物中的比例是最高的（粗壤中为92%，细壤中为82%，质地之间的P= 0.11，t=-2.04，df= 4，图5 b）。此外，与细壤相比，粗壤的所有层中富集的革兰氏阴性标记的比例显著更高（P= 0.004，t=-5.79，P= 0.019，t=-3.83，P= 0.0007，t=-9.54，df= 4）。
图5 微生物生物量中的凋落物掺入。a在两种质地的三个深度中，某一微生物凋落物脂肪酸相对于整个样品中凋落物富集脂肪酸总量的比例（%）（平均值，n = 3个独立重复）。b在两种质地的三个深度中，每个微生物组内13 C富集脂肪酸与未标记脂肪酸的比例（%）（平均值，SD显示有误差棒，n = 3个独立重复）。小写字母表示微生物组之间的差异显著（P < 0.05），而星号（*P < 0.05，**P < 0.01，*P < 0.001）表示质地之间的差异。使用非配对双侧t检验分析质地之间的统计学显著性，并使用Kruskal-Wallis检验分析微生物组之间的差异。在所有组中，深度之间的差异是显著的（P < 0.05；具有Tukey's HSD的单因素方差分析）。
5. POM表面分解活动微促进MAOM的形成：
我们使用扫描电子显微镜（SEM；图6，图7a 1和b1，补充图1）和NanoSIMS在微观尺度上直接洞察腐烂植物残留物（POM），矿物颗粒和微生物之间的地球化学界面。这种方法可以确定真菌菌丝，单细胞微生物和胞外聚合物（EPS；12C 14N-分布），土壤矿物质（16 O-分布）和凋落物来源的POM颗粒（12C-分布）的元素和同位素信息。
图6有机-无机聚合体空间结构的扫描电镜图片。植物凋落物（POM）和土壤矿物质界面的扫描电子显微镜（SEM）图像，其中土壤矿物质（a）附着在凋落物表面（比例尺= 100 µm），（b）与真菌菌丝和细胞外聚合物（EPS；比例尺= 10 µm）交织。在每种土壤质地中，从至少10个独立的位置获得类似的图像。
补充图1 封闭在由OM、土壤矿物质以及土壤微生物之间复杂的联系形成的土壤微团聚体中的POM SEM显微照片。封闭在土壤团聚体的添加凋落物（a）以及（b）显示类似生物膜的EPS表面和真菌菌丝（比例尺= 100 µm）。在每种土壤质地中，从至少10个独立的位置获得相似的图像。
本研究量化了EPS中富集的13C，其覆盖了大量的POM颗粒，形成了与13C标记的真菌菌丝和单细胞微生物交织的生物膜结构（补充图2和3）。与底层POM相比，微生物和EPS显著富集N，EPS获得的12C14N−：（12C−+ 12C14N−）比率较高，其次是菌丝和细菌（图7d）。
真菌菌丝、细菌和EPS的13C −:（12C −+13C −）比值（分别为3.0、2.3和3.0 atom % 13C）远高于天然丰度水平（1.1 atom % 13 C），与细菌和POM相比，菌丝的富集程度显著更高（P<0.05，df= 3，图7c）。
图7基于NanoSIMS成像在真菌菌丝和EPS中检测到的高13C富集。粗壤（a）和细壤（b）中玉米凋落物富集的13 C并且的并分离为颗粒有机物（POM）的SEM图像。在每种土壤质地中，从至少10个独立的位置获得类似的图像。a1/b1（a1）粗壤和（b1）细壤中测量点的SEM显微图像，随后通过纳米级二次离子质谱（NanoSIMS）进行分析。在每种土壤质地中，在POM片段的独立位置进行至少五次NanoSIMS测量，结果相似。a2/b2 NanoSIMS合成图像显示为RGB（红色=12C−，绿色=12C14 N−，蓝色=16O−）。a3/b3 NanoSIMS色调饱和度强度（HIS）图像显示了粗壤和细壤中POM、真菌菌丝和胞外聚合物（EPS）的13 C−:（12C +13C −）同位素比。其中，富集水平显示为HIS图像，其颜色范围从蓝色的自然丰度（0.01）到紫色的高富集（0.06）。比例尺=10 µm。c通过NanoSIMS获得的菌丝（n=8）、EPS（n= 16）、细菌（n=10）和POM（n= 13）的13 C–:（12 C−+13C−）同位素比和d12C14N−:（12C−+12C14N −）比的箱形图。在菌丝的连续片段、单个细菌、EPS斑块和的POM表面上手动选择感兴趣的区域。箱形图表示中位数（线）和平均值（x），其中第一四分位数（Q1）和第三四分位数（Q3）分别由箱的下限和上限表示。误差条表示数据范围，以1.5 ×（Q3-Q1）为界，单个数据点用点表示。13 C的天然丰度由阴影线指示。四组之间的显著性差异（P < 0.05）用小写字母表示。
补充图2粗壤中选定颗粒OM的NanoSIMS成像。每个数字（1-3）代表一个测量点。对于每个测量点，a为SEM显微照片、b为RGB（红色= 12C-、绿色= 12C14N-和蓝色= 16O-）的NanoSIMS合成图像和c为13C-:（12C-+13C-）比率的NanoSIMS色调饱和度强度图像，范围从蓝色的自然丰度（0.01）到紫色的高丰度（0.06）。比例尺= 10 µm。图2c显示富集13C的真菌菌丝。在每种土壤质地中，在POM片段的独立位置进行至少五次NanoSIMS测量，结果相似。
补充图3细壤中选定颗粒OM的NanoSIMS成像。每个数字（1-3）代表一个测量点。对于每个测量点，a为SEM显微照片、b为RGB（红色= 12C-、绿色= 12C14N-和蓝色= 16O-）的NanoSIMS合成图像和c为13C-：（12C-+13C-）比率的NanoSIMS色调饱和度强度图像，范围从蓝色的自然丰度（0.01）到紫色的高丰度（0.06）。比例尺= 10 µm。图1c显示富集13C的真菌菌丝以及2a-c 单细胞微生物（可能是细菌），12 C14 N−含量高，13C富集，用白色箭头标记。在3a-c中还可以看到一些生物体在每种土壤质地中，在POM片段的独立位置进行至少五次NanoSIMS测量，结果相似。
讨 论
土壤质地以及土壤的三维结构，控制整体微生物活动。粗质需要更高的凋落物OM分解率以及启动效应，从而促进原始土壤C的矿化（图1b和d）。粗壤的较大土壤孔隙中的植物凋落物碎片更容易获得。因此，凋落物分解得到加强。在粗壤中，可及性增加，因此，凋落物碳生物利用率的的增加进一步证明了在所有土壤深度的革兰氏阴性细菌中标记的PLFA的比例始终较高（图5 b）。细菌专门处理不稳定的植物C。
研究表明，粗壤提供了一个更有利于真菌的微环境中，该环境由未受保护的凋落物形成的。真菌丰度增加了五倍以上的枯枝落叶除了在粗质地的土壤。此外，真菌生物量的相当大一部分（在粗质地土壤中为92%）直接来源于添加的植物凋落物，如PLFA测量所证明的（标记的PLFA谱;图5 b）。这突出了真菌群落对凋落物快速分解的关键作用，特别是在粗糙质地的土壤中。具有独特土壤孔隙网络的土壤结构决定了微生物的丰度和群落结构，真菌主要存在于明显大于菌丝本身的大孔隙（>10 µm）中。菌丝体的丝状生长使真菌能够桥接充满空气的孔隙空间，支持它们克服潮湿和干燥土壤之间的毛细边界，并适应异质孔隙网络。因此，在粗糙质地土壤的物理条件下，真菌比其他微生物具有明显的优势，可以在难以进入的土壤隔间中获得OM，这些隔间既不通过水也不通过生物膜连接。我们的微宇宙实验表明，在砂壤土中，真菌是关键，以维持关键的土壤功能，如凋落物有机质转化为土壤有机质的C和养分循环。
在质地粗糙的土壤中，真菌活动从凋落物向外延伸，从而促进了凋落C源向下转移到更深的土层中（PLFA深度剖面；图4）。这种模式可以部分归因于真菌菌丝体的顶端优势，使得C源能够在整个真菌菌落中移动。菌丝网络的扩展促进了凋落物进入聚集体。微生物在土壤团聚体形成过程中具有决定性作用，团聚土壤结构的稳定部分归因于EPS的渗出（例如，多糖，图7a和b）。我们认为真菌菌丝的扩张及其与矿物颗粒的相互作用导致了凋落物衍生的oPOM在远离凋落物来源的深层土壤中的积累（图2b）。真菌菌丝、植物残体和粘附于微生物来源的EPS的矿物质颗粒之间的这种复杂的相互作用通过光谱显微成像来揭示（图6和图7）。通过直接测量完整的植物-真菌界面，真菌在凋落物碳C的转运中起到关键作用，以及在团聚体和矿质有机碳的形成中过程中的关键作用，最终促成凋落物C在土壤中的稳定。
研究表明植物C直接在植物残体和土壤矿物质的界面处并入微生物生物量。这通过POM表面上真菌菌丝和微生物EPS中13 C富集来量化。矿物质（16 O-分布；图6）和微生物生物量（12 C14 N-；图7）之间的直接联系，以及新鲜凋落物（POM）与真菌菌丝和微生物来源的EPS（图7a和b）之间的相互作用，促进了细粒土壤矿物的凝聚。在植物-土壤界面，由微生物活性驱动以及凋落物碳源调控的细粒土壤矿物的凝结过程，直接驱使团聚体的形成以及土壤结构的发育。此外，通过这种土壤结构形成的闭塞在土壤团聚体中的（oPOM）凋落物有机质的化学成分类似于未分解的凋落物。因此，颗粒有机质在土壤团聚体的形成扮演着重要的角色并将来自凋落物的POM类似地封闭到土壤团聚体中（图8）。
2017年12月，从德国南部（巴伐利亚州弗赖辛，48°23′53.8″N，11°38'39.7″E）的农田采集5 - 20 cm（Ap层）的土壤。研究区位于巴伐利亚高地下部，年平均温度为7.8℃，年平均降水量为786 mm。土壤类型为雏形土（粉质粘壤土；32%粘土，53%粉砂和14%砂），含有大量黄土，与下第三系桑迪沉积物混合。选择的土壤代表了广泛分布的土壤类型和土地利用。将收集的土壤烘干（2天，40 °C），过筛（<2 mm），并使用镊子手动去除可见的植物残留物。
实验设计包括四个处理。两种质地的土壤，13C标记玉米秸秆，以及未标记的玉米秸秆。为了得到质地较粗的土壤（砂质粘壤土； 24%粘土，15%粉砂和60%砂），将一半的初始土壤与清洁的石英砂（Quarzwerke，Frechen，德国）混合，以将砂含量从14%增加到60%（补充表3）。为了在处理之间的堆积密度（0.9-1.3 g cm-3）一致，将120 g（对于较粗糙的质地）和90 g（对于较精细的质地）土壤均匀地填充并轻轻地填充到微宇宙中（高度：5 cm，内径：5 cm，总体积：98.2 cm-3；聚甲醛，1.4 g cm-3；Sahlberg，慕尼黑，德国）。
而对照微宇宙完全填充有土壤，330 mg风干和磨碎的13 C标记的玉米秸秆（2-3 mm，δ13 C = 2129 ± 82‰ V-PDB；补充表4; Agroscope，苏黎世，瑞士）混合到其他微生态系统内上部1.67 cm的土壤中，以创建准自然梯度，从顶部添加地上凋落物（图9）。选择玉米作为凋落物基质，因为它是全球农业系统中种植的作物。四个处理中的每一个重复五次。用聚酯纱布（37-µm目）从下方密封微宇宙，并置于金属网格顶部的球梅森罐（475 ml）中，以确保气体向下扩散。
图9不同质地土壤中13C标记凋落物培养试验装置。（1）通过将石英砂添加到壤土材料中获得粗壤，与仅由原始土壤材料组成的较细质地的土壤中的14%相比，达到60%的总砂含量。（2）通过将13C标记的植物凋落物与均质化的土壤混合来制备宇宙的最上层。三分之二的微宇宙充满了土壤材料，并添加了准备好的凋落物层作为顶层。（3）将四种处理（添加或不添加植物凋落物的两种土壤质地）中的每一种的五个重复培养95天。对所有五个重复的呼吸进行测量（a）。（4）每个微观世界被切割成三个深度，此后总是单独分析深度增量。（5）虽然对所有5份重复样品进行了原液分析（b），但根据C和N浓度选择了3份代表性重复样品进行物理分馏（c）和磷脂脂肪酸分析（PLFA；d）。分析所获得的有机物质分级（POM和MAOM）的C、N和13 C（c1），并通过13 C CP-MAS NMR光谱法测定级分的化学组成（c2）。最后，对从两种质地的样品中手工挑选的颗粒OM进行扫描（SEM）和纳米级二次离子质谱（NanoSIMS）测量（e）。
补充表3. 培养前两种质地的土壤的基本性质
补充表4. 富集13C植物凋落物的元素特性。
使所有容器密闭并用合成空气（Westfalen AG，明斯特，德国）冲洗后，在第2、3、4、8、10、15、23、31、44、65、80和95天从梅森罐的顶部空间收集12 ml气体样品（IVA Analysentechnik，米尔布施，德国）。测量时，对容器内空气进行两次采样，并且两次采样之间的时间适应当前呼吸速率。在95 d的培养期内，通过气相色谱同位素比质谱法（GC/IRMS; Delta Plus，Thermo Fisher，Dreieich，德国）测量CO2浓度以及呼吸产生的CO2中的13 C丰度。根据三种校准气体（890、1500和3000 ppm CO2; Linde AG，Pullach，德国）校准CO2水平。然后，用已知同位素组成的二氧化碳稀释在氦气中，用作实验室标准。该标准品又根据三个国际标准品（RM 8562、RM 8563和RM 8564；奥地利维也纳国际原子能机构）采用双入口系统进行校准。温度和持水量随培育期沿着分别恒定在21℃和60%。
孵育95天后，用剃刀刀片将每个微宇宙切成三个水平切片，将顶层、中部和底层分开（各1.67 cm高）。微观宇宙能够从侧面打开，允许精确分离深度增量（补充图4）。将用于后续微生物分析的子样品冷冻干燥并储存在4 °C下，并将用于分级的干燥等分试样储存在20 °C下的密封塑料容器中。此外，手动选择一些POM颗粒用于NanoSIMS测量。
补充图4 土壤微观世界采样和深度增量。a培养后将土壤微生态系统分成两半，b使用无菌刀片切成三个深度增量（每个1.67 cm高）。
使用组合密度和粒度分级方案11将土壤分离成五个不同的OM组分。用多钨酸钠溶液（Na 6 [H2 W12 O 40]; 1.8 g cm-3）处理干燥的土壤（18-20 g），12 h后，使用真空泵收集自由漂浮的颗粒有机物（fPOM）。oPOM通过超声波分散（Bandelin，Sonoplus HD 2200;能量输入为440 J ml-1）从土壤团聚体中释放，使其与较重的矿物分离。通过用去离子水在筛（20-μm筛目尺寸）上洗涤oPOM来从oPOM中除去过量的盐，这产生<20 -μm的oPOM级分（oPOM小）。fPOM和oPOM级分均使用去离子水洗涤数次并进行压滤（20-µm筛目），直至溶液通过压滤降至<5 µS cm-1的电导率以下。通过用去离子水饱和24小时来清洁oPOM。砂和粗粉砂部分通过湿筛分离，小于20 µm的矿物部分通过沉淀分离，然后合并为一个MAOM部分。使用同位素比质谱仪（Delta V Advantage，Thermo Fisher，Dreieich，德国）和元素分析仪（Euro EA，Eurovector，Milano，意大利），通过燃烧测定冷冻干燥和研磨的OM组分以及研磨的散装土壤的C、N和13 C含量。乙酰苯胺用作校准的实验室标准品，并测定系统的同位素线性，然后根据几种合适的同位素标准品进行校准。
POM级分的化学组成通过固态13 C CP-MAS NMR（Bruker DSX 200，Bruker BioSpin GmbH，Karlsruhe，德国）测定，其中将样品填充到7-mm二氧化锆转子中并在魔角旋转探针中以6.8 kHz的旋转速度和0.01024 s的采集时间旋转。对光谱在以下化学位移区域的13 C进行定量：烷基C（−10-45 ppm）、O/N烷基C（45-110 ppm）、芳香族C（110-160 ppm）和羰基/羧基C（160-220 ppm）11。对这些区域进行积分，并计算烷基C：O烷基C比率（−10-45/45-110 ppm），以描述不同馏分的异构度43。最后，通过分子混合模型将获得的光谱转换为具有以下化学位移区域：0-45、45-60、60-95、95-110、100-145、145-165和165-215 ppm的OM化合物。
计算每小时呼吸的C（公式1）。
其中ΔCO2/Δt是随时间的增加CO2的量，VHSP是梅森罐顶部空间的体积，21 °C下理想气体的体积设定为24.1，12表示C的原子质量。
随后，计算凋落物呼吸CO2百分比（等式2）。
式中，δ 13 Cresp排放量给出了两次采样之间当前CO2排放量的δ 13C（‰ V-PDB），δ 13 Ccontrol是测量时对照土壤的平均δ 13C，δ 13 Clitter是标记凋落物的δ 13 C特征。最后，计算了原始土壤呼吸碳（等式3）。
计算OM组分中凋落物C（%）的比例（公式4）。
其中δ13Clabeled标记是标记样品中的富集的13C，δ13Ccontrol是对照中的富集的13C（天然丰度水平，即，28‰ V-PDB），δ13 Clitter为添加凋落物中的富集的13C（即，2129‰ V-PDB），然后可以从中确定每个OM中的掉落物C的量（公式5）。
式中，Cfraction为C的量，单位为mg g-1，m为分馏后各馏分的质量（g）。
分析PLFA图谱并根据ISO/TS 29843-2：2011 F标准进行调整。总之，用Bligh和Dyer溶液[甲醇、氯仿和柠檬酸盐缓冲液（pH = 4 ± 0.1），2：1：0.8，v/v/v]提取3 g土壤（冻干等分试样）中的土壤脂质。通过加入氯仿和柠檬酸盐缓冲液获得两相系统，在氮气流30 °C条件下从其中蒸发脂质相。通过硅胶管固相萃取（SPE DSC-Si，500 mg，Discovery®）将磷脂与中性脂质和糖脂分离并蒸发。PLFA通过碱性甲醇分解47转化为脂肪酸甲酯（FAME），随后通过气相色谱仪（GC Agilent HP 6890，G1530 A，Chemstation，Santa Clara，USA）的气相色谱保留时间比较进行定量，该色谱仪连接到配备有毛细管柱（SGE，BPX 5，60 m× 0.25 mm× 0.25 mm）的火焰离子化检测器。相对于十九烷酸甲酯（19：0）定量FAME浓度，从而能够鉴定甲基化脂质。使用标准土壤并平行提取，以检测提取轮次之间的潜在偏差，以nmol C-FA/g土壤表示。将单不饱和和环丙基化PLFA（C16：1 w7 c、C18：1 w 9 c和C18：1 w 9 t）分配给革兰氏阴性细菌，将同支化和反异支化PLFA（iC 15:0、aC 15:0、iC 16:0、i-C 17:0、C :17和C 18:0）分配给革兰氏阳性细菌，将C 18:2w6c、C18：3w3c和C 20：5w3c分别分配给真菌。通过将革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌与标记物C14:0、C 16:0、C 20:0和C15:1相加来表示细菌的总含量。最后，通过校正甲醇分解过程中添加的甲基部分，得出FAME的13 C标记并将其与脂肪酸的链联系起来（公式6）。
其中δ 13 CFA代表脂肪酸的δ 13 C，Cn是脂肪酸中的C原子数，δ 13 CFAME是脂肪酸甲酯的δ 13 C，δ 13 CMeOH是用于甲基化（−63%）的甲醇的δ 13 C，以计算脂肪酸的同位素比。通过将每种脂肪酸的比例与总13C掺入相关联来计算13C掺入到四个微生物组中的相对掺入，并且通过将富含13C的脂肪酸的量除以该特定组的提取的脂肪酸的总量来计算13C在每个微生物组中的绝对掺入。
为了深入了解微生物和矿物的凋落物组合的微观分布，我们使用了SEM和NanoSIMS。将来自未分级的土壤的游离POM手工挑选并固定到金属短柱（直径10 mm）上的石墨烯样品基座上。为了避免充电现象，在SEM分析之前，在氩气气氛下通过物理气相沉积对样品进行金涂覆（Alumtech Sputtercoater SC 7620，Gala Instrumente，Bad Schwalbach，德国）。为了分析POM组合物的微尺度结构，首先使用SEM（Jeol JSM 5900 LV，Freising，德国）分析样品的微生物和土壤矿物质，随后，使用Cameca NanoSIMS 50 L（Cameca，Gennevilliers，France）分析凋落物表面分解（POM）最典型的区域。对于NanoSIMS测量，使用270-pA高初级束局部溅射掉杂质和金涂层，并将初级离子（Cs+）注入样品表面（16 keV的冲击能量）以提高次级离子的产率。随后，使用电子倍增器测量二次离子; 12 C-、13 C-、12 C14 N-显示OM碎片，16 O-、28 Si-、27Al 16 O-和56Fe16 O-二次离子记录矿物相。该仪器被调谐到高质量分辨率，以准确分离质量为13的质量等压线（13C-，12 C1H-）。所有测量均采用25×25 µm、40个平面和1 ms pixel-1驻留时间采集离子图像。如有必要，用电子淹没枪补偿充电效应。所获得的测量值是死区时间（44 ns），并且使用ImageJ软件的OpenMIMS插件进行漂移校正。13C-:（12C-+13C-）和12C14N-:（12 C-+12C14N-）的比率是针对不同的感兴趣区域计算的，这些感兴趣区域是根据主要隔室手动选择的：真菌菌丝的连续片段、单个细菌、EPS斑块以及暴露的POM表面。为了解释仪器质量分馏，仔细检查电子倍增器，并且沿着会议定期进行未标记POM样品的对照测量。这里，平均13C-:（12C-+13C-）比率与天然丰度水平一致，这意味着没有必要校正标记POM样品的比率。
使用Shapiro-Wilk检验分别检验所有参数的正态性，并使用Bartlett检验分别检验所有参数的方差齐性。此外，使用Q-Q图检查数据集的分布。在不符合正态性或方差齐性假设的情况下，对原始数据进行对数转换，并对对数转换数据进行分析。使用非配对t检验测试由质地和凋落物添加引起的差异，并且使用单因素方差分析测试深度差异，其中Tukey的显著性差异作为事后检验。如果对数转换数据不符合参数检验的要求，则应用非配对双样本Wilcoxon检验或Kruskal-Wallis检验。如果置信度超过95%（P < 0.05），则认为统计学结果具有显著性。所有统计测试都是在R统计环境50中使用agricolae 和ggpubr 软件包进行的。
SOC是维持土壤健康和农业可持续性的关键因素，对碳的长期储存具有重要意义。土壤中的有机碳能够以多种形态存在，其中颗粒有机质是相对容易分解的一种。这个工作假设并讨论了POM不仅仅是一个易降解的碳库，而是可以成为土壤中持久性有机碳的重要来源，尤其是在特定的土壤环境条件下。POM能与矿物和微生物相互作用，成为SOC稳定的重要组成部分。因此，POM的物理保护作用可能比之前认为的更为重要。
作者 | 丽平
编辑 | 回毅滢
