项目文章Cell Reports(IF=7.5) | 科学家首次构建人类、大鼠海绵体空间图谱

阴茎勃起是一个复杂的生物学过程，整个过程需要神经、内分泌、血管和阴茎海绵体组织精密调节、协调完成。海绵体损伤可引起多种疾病，包括影响了5%~22%男性的阴茎勃起功能障碍（ED）。

此外，多数ED相关研究是基于大鼠模型的，但当前对于大鼠和人类间阴茎海绵体（CC）的解剖学和信号网络差异认识尚不清晰。因此，为了更好的使用大鼠模型开展研究，有必要深入研究大鼠阴茎海绵体的结构/功能调控与人类的异同。

研究材料：4例阴茎癌患者，3例健康志愿者，10例DMED（糖尿病性勃起功能障碍）患者；4只健康大鼠，6只DMED大鼠模型。

研究方法：Masson/H&E染色（n=7），scRNA-seq（n=12，3例健康人类CC/3例DMED人类CC，3例健康大鼠CC/3例DMED大鼠CC），空间转录组技术（BMKS1000，n=3，1例阴茎肿瘤患者、1例勃起功能正常雄性大鼠以及1例DMED模型大鼠）等。

• 人类和大鼠CC细胞和空间特征

通过scRNA-seq数据，研究者在人类CC（阴茎海绵体）中鉴定出7种类型细胞，仅在大鼠CC中发现一小部分中性粒细胞和B细胞。使用scRNA-seq数据对空间转录组数据进行注释（CellTrek），研究者得到了人类和大鼠CC样本空间细胞分布图谱（level3，20μm分辨度），发现虽然人类和大鼠CC中的细胞类型相似，但每种类型细胞比例、空间分布特征存在异质性。

图1-通过scRNA-seq和空间转录组技术得到的人类，以及正常/DMED条件下大鼠的CC细胞全局表达谱

• 人类和大鼠CC组织中的空间异质性

作为一种特殊的血管窦结构，当前已初步认识到CC上不同区域的类型不同。得益于空间转录组技术，研究者发现人类CC组织中SVG（空间差异基因）top（如CCL18、PLA2G2A、C3）主要在不同类型细胞中表达，但有一些表现出空间分布特异性的基因并没有在scRNA-seq数据中表现出细胞类型特异性；人类CC组织3个代表性区域中，不同区域的细胞比例不同，如区域I（海绵体动脉区域）EC（内皮细胞）占比更高，而区域III（白膜附近区域）包含更少的FB（成纤维细胞）但SMC（平滑肌细胞）丰富。大鼠CC组织也表现出相似的情况（大鼠CC中缺乏梳状中隔和明显的海绵体动脉，研究者根据人类CC代表性区域的空间位置，在大鼠CC中也划分出可比较的3个代表性区域）。

图2-人类CC组织的转录特征和空间异质性

• 根据scRNA-seq数据比较人类和大鼠CC中的细胞类型

多数勃起调控研究是基于大鼠模型的。为了理解大鼠和人类间CC微环境的异同，研究者通过分析scRNA-seq数据中的人—大鼠同源基因，发现虽然人类和大鼠物种不同，但CC中相同类型细胞仍可以聚成同一簇，进一步分析发现人类和大鼠CC中相同类型细胞的转录相似性>70%且正相关，表明在多数情况下，使用大鼠模型模拟、研究人类CC微环境的转录调控是可接受的。然而，人类和大鼠CC中相同类型细胞的DEGs（差异表达基因）top并不一致，提示当研究者更关注一个或几个基因或通路时，使用大鼠模型要特别注意。

附录图7-scRNA-seq数据评估得到的大鼠和人类CC间相似性和差异性

• 比较人类和大鼠CC空间转录组全局

通过分析空间转录组数据中的人—鼠同源基因，研究者找到人类和大鼠共有的459个top SVG，大多数SVG并不是细胞类型特异的，其中EC、FB和SMC是表达这些SVG最多的3种类型细胞。富集分析结果显示，基础生物学过程如“translational initiation”、“extracellular structure organization”以及“protein targeting”，在人类和大鼠CC组织的空间转录组数据中是保守的；人类特异SVG主要与炎症响应有关，而这些SVG的大鼠同源基因主要与代谢过程有关。

图3-比较大鼠和人类CC微环境中的空间差异基因和信号通路

• 人类和大鼠CC微环境中的细胞—细胞互作分析

为了研究、比较人类和大鼠间CC微环境的复杂信号网络，研究者使用scRNA-seq数据进行CellChat分析，发现大鼠CC中的细胞互作数量虽然小于人类，但细胞互作强度是相似的。基于这些互作的表达模式，研究者进行简单的分类，发现虽然胞外基质相关的互作整体强度与细胞类型间配体-受体强度相当，但两者基因组成是有差异的；血管生成相关的互作整体强度在人类和大鼠中没有差异，但基因组成存在差异，如大鼠CC微环境中是主要是VEGFB表达，而人类CC微环境中高表达的是VEGFA和IGF1。

空间转录组数据显示，VEGF配体主要集中富集在人类CC中的海绵体动脉（区域I）附近，而在蛋白质水平，VEGFA和IGF1并不共定位。大鼠中VEGF和IGF基因的空间分布模式与人类的相似，但蛋白质水平上区域I中存在高浓度的VEGFA和IGF1。此外，免疫相关的互作在人类CC与大鼠CC中表现出相似或者更高的整体信息流，但一些配体亚型在大鼠中高表达。

这些scRNA-seq数据的分析结果与基于空间转录组数据SVG的富集分析结果高度一致。

图4-配体-受体对分析显示人类和大鼠CC组织中的细胞—细胞通讯

• EC表现出显著的空间异质性和物种差异

根据以往的解剖观察以及scRNA-seq数据分析，可知CC中包含3种类型EC（内皮细胞），包括GJA5+ EC（动脉内皮细胞）、SELP+ EC（静脉内皮细胞）以及KIT+ EC（海绵体窦内皮细胞）。人类CC中GJA5+ EC占比最低，主要分布在海绵体动脉区域；SELP+ EC主要分布在白膜区域；KIT+ EC广泛分布。但大鼠CC中，Selp+ EC比例更高，Gja5和Kit可能并不是有用的静脉和CC内皮细胞标志物。基于scRNA-seq数据进行GO分析，研究者发现不同类型EC富集了不同功能，多数细胞类型特异性的term（条目）在人类CC中并没有空间分布异质性，但一些特殊term在大鼠CC中表现出空间分布异质性。

附录图10-人类和大鼠EC簇间的物种相似性和异质性

• SMC表现出显著的空间异质性和物种差异

根据以往研究结果，研究者将CC中的SMC（平滑肌细胞）簇分为VSMC（血管平滑肌细胞）和CCSMC（海绵体小梁平滑肌细胞）。数据分析结果显示，两种类型SMC在物种间存在显著差异，其中人类CCSMC高表达DES，VSMC高表达RGS5；大鼠CCMS和VSMC可通过Igfbp2和Rgs5区分；蛋白质水平上，CCSMC与VSMC不同，后者不表达肌动蛋白或肌球蛋白；根据SMC的SVG空间分布模式，发现ACTC1/Actc1只在人类CCSMC中表达；前期研究发现ADRA2A在人VSMC表达，ADRA2C在人CCSMC中表达，空间转录组数据也验证了这一发现，但大鼠CC中Adra2a并没有表现出细胞类型特异性而Adra2c的表达未检测到，提示在这个方面大鼠并不是合适的研究模型。

图5-人类和大鼠SMC簇间的物种相似性和异质性

• 人类和大鼠FB有相似的聚类特征和空间分布，但亚型比例不同

近期，CC的FB（成纤维细胞）成为研究热点，但对其空间和物种异质性仍不清楚。研究者根据PI16、APOE及其他载脂蛋白、COMP的表达情况，将人类CC FB分成3种亚群。空间转录组数据分析结果显示，人类CC中3种FB亚群空间分布模式不同，富集的功能也不同；大鼠CC FB表现出与人类CC FB相似的亚群和标志基因，但每种亚群的比例与人类显著不同。

APOE与脂滴转运密切相关。油红O染色显示大鼠CC中脂滴位置与Apo+ FB的空间分布高度一致，且都在白膜下富集；免疫荧光染色结果显示大多数脂滴与APOE蛋白共区域化出现且在白膜下有更高的富集，特别是在区域III（左右CC连接区域）；人类CC中APOE分布特征与大鼠类似但表达更广泛。

前期研究成果显示，FB是人类CC中最强的外向信号源，在调控微环境稳态中起到重要作用。因而，FB表型转变可能与CC结构和功能变化密切相关。通路活性分析显示PI3K通路活性分值与APO+ FB有相似的空间分布模式，而TNF-α和TGF-β的空间分布模式与之相反；空间上CCSMC与FB相距较远（level13，100μm分辨度分析FB生态位），而GJA5+ EC、VSMC、SWC（Schwann细胞）和T细胞与COMP+ FB空间距离较近，表明COMP+ FB与神经和血管密切相关；CXCLs、CCN2以及C3与3种FB亚群生态位正相关，但CCN5和C7与COMP+ FB生态位负相关，GREM1不与PI16+ FB或APO+ FB相关但与COMP+ FB生态位显著正相关。

图6-CC中不同成纤维细胞亚群表现出不同的空间分布特征

• CC中机械力信号存在空间异质性，并调控FB表型转变

以往研究表明病理条件下YAP信号诱导FB-肌成纤维细胞表型转变，但这不能完全解释生理条件下存在着的多种FB亚型，特别是有高脂质代谢活性的APO+ FB。有报道ECM（胞外基质）机械力调控多种细胞类型的脂质代谢。

本研究中，研究者发现COMP+ FB生态位显著富集了“integrin-mediated signaling pathway”和“response to mechanical stimulus”term；人和大鼠CC中ECM/细胞组成比例表现出明显的空间异质性；空间转录组数据和免疫荧光染色结果类似，靠近阴茎背神经血管束的上极区域显示出较低的纤维化水平，而远离背神经血管束的显示出较高的纤维化水平；空间转录组数据和超声弹性成像结果都表明，APO+ FB与更柔软的组织硬度有关，而COMP+ FB与更硬的组织有关；不同胞外基质硬度培养下的CC FB形态不同，bulk RNA-seq数据显示机械应激显著改变了FB的转录状态，一些参与调控脂质代谢的基因与低机械力信号有关；scRNA-seq数据分析结果显示APO+ FB分值随组织硬度增加而降低，COMP+ FB分值随组织硬度增加而增加；染色结果显示随着组织硬度增加，FB中的中性脂质和胆固醇累积降低。

综上，这些结果表明机械力信号直接参与调控FB的表型转变。

图7-局部机械力信号强度决定了这个区域内成纤维细胞的表型

• 人类和大鼠CC经历了相似的DMED病理变化

为了更好的认识DMED病理条件下，人类和大鼠CC微环境发生的变化是否与每种CC细胞类型中发生的分子水平变化相一致，研究者通过分析scRNA-seq数据，发现DMED大鼠模型和DMED患者都经历了显著的纤维化以及细胞组分丢失，但两者间的转录组差异显著。富集分析结果显示，仅DMED大鼠模型富集了“extracellular structure organization”；“actin cytoskeleton or organization”和“oxidative phosphorylation”仅在人类DMED患者SMC中发现，“regulation of MARK cascade”仅在DMED大鼠模型SMC中富集；“rhythmic process”仅在人类DMED患者FB中富集，“leukocyte activation”仅在DMED大鼠模型FB中富集。

空间转录组数据显示DMED大鼠模型阴茎中，除尿道以外的组织区域转录表达水平整体降低，而scRNA-seq数据显示DMED状态细胞的转录水平高于正常状态的细胞，这或许意味着，可能是由于单位面积上细胞数量降低，导致空间转录组数据出现转录水平降低的现象。

附录图13-通过scRNA-seq和空间转录组评估DMED条件下CC的病理变化