非编码 RNA（ncRNA）是指不通过编码蛋白质发挥功能的RNA，研究较多的非编码RNA包括lncRNA、miRNA、circRNA等。近日Cell期刊中发表了一篇关于ncRNA的综述，题为”Small and long non-coding RNAs: Past, present, and future[1]”,详细说明了两种常见的非编码RNA（lncRNA和miRNA）的研究历程、作用方式等进行了详细描述，包括对小RNA作为转录后阻遏因子的作用机制，以及以XIST、NEAT1等为例说明了lncRNA的顺式反式调控，以及与RNA结合蛋白 （RBP）的相互作用等调控方式。作者认为，尽管小RNA的研究在近30年来已取得了丰富的研究结果，但关于新的ncRNA的种类、修饰以及在单分子和高分辨率水平上的研究一定会带来其他激动人心的研究成果。本期为各位老师带来一篇关于小RNA及lncRNA研究的高分经典案例解读，希望能为各位老师后续研究激发新的研究思路~![]()
中文题目：Klotho衍生肽1通过转录后调控恢复Klotho表达抑制纤维化肾脏细胞衰老
英文题目：Klotho-derived peptide 1 inhibits cellular senescence in the fibrotic kidney by restoring Klotho expression via posttranscriptional regulation[2]
合作单位：南方医科大学
发表期刊：Theranostics
影响因子：12.4
百迈客生物为该研究提供了miRNA测序服务。
慢性肾病（CKD）是一种持续 3 个月以上的肾功能不全病症，特征通常是细胞衰老增加、表观遗传重编程、持续的成纤维细胞活化和持续的细胞外基质（ECM）产生，与老年肾脏存在很多相似之处，因此，CKD现在被认为是一种肾脏过早和加速衰老的状态。抗衰老蛋白 Klotho 属于由α和β亚型组成的单跨膜蛋白小家族，肾损伤会导致Klotho表达下调，Klotho 缺乏可导致高磷血症、肾小管细胞衰老和肾纤维化等，进一步加速 CKD的进展，因此Klotho 被认为是肾脏疾病诊断和预后的潜在生物标志物和治疗靶点。然而由于Klotho 是一种大型跨膜蛋白，临床生产成本高且难度大，因此作者团队在前期报道了Klotho衍生肽1（KP1） 的发现，可通过结合TGF-β 受体2（TβR2） 并抑制 TGF-β/Smad3 信号转导来减轻肾纤维化，且生产上会更便捷经济，有可能替代 Klotho 进行临床转化，为了进一步研究 KP1 在保护肾脏中的作用，作者在本篇研究中检查了其对细胞衰老的影响。
材料：8-10周龄雄性C57BL/6小鼠假手术组（sham）、单侧缺血再灌注损伤（UIRI）组别小鼠和治疗组别小鼠（UIRI + KP1）共三组小鼠肾脏组织；
方法：miRNA测序+双荧光素酶报告基因检测+RNA 荧光原位杂交等
WB检测了许多细胞衰老标志物如p21、p16和γ-H2AX的表达，结果表明了UIRI 诱导纤维化肾中对应标志物的表达，而KP1明显消除了这种诱导。此外针对其内源Klotho 的检测也证明UIRI 导致肾脏中Klotho 的丢失而KP1在很大程度上恢复了它们的表达，单侧输尿管梗阻（UUO）诱导的 CKD 模型以及体外细胞模型中也出现了类似的结果，此外，UIRI 还导致 Klotho mRNA 的显着下调。然而，KP1 不影响 Klotho mRNA 的稳态水平，说明KP1通过独立于转录调控的机制诱导 Klotho。
此外，通过流式细胞术进行的细胞周期分析表明，TGF-β1 孵育后的衰老原代肾小管细胞停滞在 G1 期，这被 KP1 处理抵消，证明了KP1阻断细胞衰老的能力，而在可以阻断新mRNA合成的放线菌素D（ActD）存在下与 TGF-β1 孵育后 12 小时和 24 小时，KP1 不会影响 Klotho mRNA 水平，进一步证实了 KP1 诱导 Klotho 蛋白表达而不影响其mRNA和蛋白质稳定性。由于 KP1 不影响 Klotho mRNA 水平和蛋白质稳定性，作者开始探索 KP1 是否通过miRNA调节 Klotho 蛋白，在 UIRI 肾脏中鉴定到了68个上调miRNA，在注射 KP1 后恢复到基线，其中 10 个与 Klotho mRNA 的 3'-UTR 特异性结合，其中miR-223-3p表现非常明显，且在对公共转录组数据集分析后发现，miR-223-3p 与 Klotho 水平呈负相关，支持了 miR-223-3p 与 Klotho 调节的相关性。为了证实 miR-223-3p 在 Klotho 表达中的调节作用，作者进行了双荧光素酶报告基因测定，转染 miR-223-3p 模拟物降低了含有野生型未突变型 Klotho mRNA 序列的报告基因的荧光素酶活性，表明 miR-223-3p 可以特异性靶向 Klotho mRNA，抑制其活性，用miR-223-3p转染HK-2细胞进一步证明miR-223-3p抑制 HK-2 细胞中 Klotho 蛋白的表达。体内模型原位杂交验证了miR-223-3p 在 UIRI 肾肾小管上皮中被诱导，而KP1抑制了miR-223-3p表达，结合免疫荧光染色结果证明了KP1 可以通过在体内抑制 miR-223-3p 来恢复 Klotho 表达，在体外的HK-2 细胞中的miR-223-3p及其拮抗剂转染实验也呈现出了相同的结果。为了进一步验证实验结果，作者对小鼠模型静脉注释miR-223-3p 表达质粒和 KP1构建体内表达模型，结果显示，miR-223-3p 的过表达加剧了 p16 、 γ-H2AX 、纤连蛋白、 I 型胶原和 α-SMA 的表达，所有这些都被 KP1 抑制，而miR-223-3p拮抗素的注射同样消除了 UIRI 小鼠中的 p21、p16 和 γ-H2AX、纤连蛋白、胶原蛋白 I 和 α-SMA，恢复了肾功能。而 KP1、SB431542 （TβR1/2 抑制剂） 和 SIS3 （p-Smad3 抑制剂） 处理 TGF-β1 刺激的 HK-2 细胞结果进一步阐明了，KP1 通过阻断 TGF-β1/Smad3/miR-223-3p 信号传导来恢复 Klotho 表达并防止细胞衰老。由于 miRNAs 和 lncRNAs 经常相互作用并相互调节，作者搜索了几个 lncRNA-miRNA 相互作用数据库，并预测 miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 （牛磺酸上调基因 1） 具有推定的结合位点，双荧光素酶报告基因测定验证了miR-223-3p 降低了野生型TUG1报告基因的荧光素酶活性，且在 HK-2 细胞中过表达 miR-223-3p 抑制了 lncRNA-TUG1，而KP1则消除了这个效果，TGF-β1抑制了HK-2细胞中lncRNA-TUG1的表达，而KP1、SB43154或SIS3则消除了此类效果，这些结果表明lncRNA-TUG1受TGF-β/Smad信号传导的调节。而LncRNA-TUG1 沉默也降低了 Klotho 蛋白，但没有降低其 mRNA 水平，说明miR-223-3p 可以与 lncRNA-TUG1 相互作用，形成竞争性内源性 RNA （ceRNA） 网络，从而放大其在调节 Klotho 表达和细胞衰老中的作用。体内UUO和UIRI 模型中都验证了这一点。综上所述，miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 协同工作，导致 Klotho 丢失、细胞衰老和肾纤维化，所有这些都被 KP1 缓解。KP1 是一种新发现的 Klotho 衍生肽，通过恢复 Klotho 表达来抑制细胞衰老，KP1 的这种作用由 miR-223-3p 和 lncRNA-TUG1 介导的转录后调节运作。通过恢复 Klotho 表达，KP1 充当 Klotho 诱导剂，并具有广泛的肾保护特性，例如抗氧化、抗衰老和干细胞保护，有望将KP1转化为 CKD 患者的临床治疗。![]()
本研究中利用miRNA测序、公共lncRNA数据库以及公共转录组数据集共同分析出了miRNA与lncRNA共同构建ceRNA网络在转录后水平调控蛋白表达的作用机制，对于较新的研究来说，可以直接通过全转录组，利用同一来源组织构建两个文库（lncRNA及小RNA文库）得到包括lncRNA、miRNA、mRNA以及circRNA的结果，由此可分析出更可靠的相关性调控网络，便于筛选关键非编码RNA。[1] Chen LL, Kim VN. Small and long non-coding RNAs: Past, present, and future.Cell. 2024 Nov 14;187(23):6451-6485. doi: 10.1016/j.cell.2024.10.024. PMID:39547208.[2] Zhang X, Li L, Tan H, Hong X, Yuan Q, Hou FF, Zhou L, Liu Y. Klotho-derived peptide 1 inhibits cellular senescence in the fibrotic kidney by restoring Klotho expression via posttranscriptional regulation. Theranostics. 2024 Jan 1;14(1):420-435. doi: 10.7150/thno.89105. PMID: 38164143; PMCID: PMC10750200.
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北京百迈客生物科技有限公司(简称：百迈客生物)成立于2009年，是一家提供基因多组学测序服务和单细胞组学&空间组学仪器设备的高新技术企业。业务主要包括科技服务、智能制造两大业务板块。全球化的业务布局，在中国、欧洲等地区拥有以博士和硕士为主体的研发及服务团队，先后在Cell、Nature、Science等国际期刊上发表文章数千篇，累计影响因子超万分。拥有Illumina、MGI、PacBio、Nanopore、AB SCIEX、Waters、BMK Manu、10X等二代测序、三代测序和质谱检测平台，自主创新的百灵实验室全自动生产线、BMKCloud多组学大数据智能交付平台及亚细胞级S系列空间组学产品，为全球科研单位、育种机构、医药公司等提供高品质基因多组学服务和产品。
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