利用上述详细的体内和体外酶活性测定，描绘了完整的AG生物合成途径（图4a）。具体路径为：AmCYP88D25催化2的C-16羟基化生成6，随后作为底物分别由AmCYP88D7和AmCYP71D756催化C-6羟基化和C-24,25环氧化形成12。然后，AmOGD1催化12的C-20羟基化，随后进行分子内加成反应生成3。AmGT36和AmGT11在并行途径中进一步对3进行糖基化，形成1。为了进一步验证该途径在植物中的有效性，利用RNA干扰（RNAi）介导的基因沉默来生成黄芪的转基因毛状根，并成功获得了23个独立转化的RNAi株系，分别靶向AmCYP88D25、AmCYP88D7、AmCYP71D756、AmOGD1、AmGT11和AmGT36。与每个RNAi 株系中目标基因的有效沉默相一致，AGs生产量显著减少。与此同时，在AmCYP71D756-RNAi和AmGT36-RNAi株系中观察到中间体8的显著积累，以及1的类似物。这些发现直接证实了AG生物合成基因所提出的作用，从而确认了植物中推断的AG生物合成途径（图4a）。The relative content of 1 (blue columns) and AG III (orange columns) in AmCYP88D25-RNAi lines (a), AmCYP88D7-RNAi lines (b), AmCYP71D756-RNAi lines (c), AmOGD1-RNAi lines (d), AmGT11-RNAi lines (e), and AmGT36-RNAi lines (f)
烟草中实现AG生物合成
在确定了负责1生物合成的所有酶（图4a）后，在烟草中重建了完整生物合成途径。在烟草中表达AmOSC3、AtCPR1以及本研究中鉴定的所有六种修饰酶后，观察到1的产生（0.293 mg/g植物干重；图4b）。通过过表达上游三萜前体形成途径基因NbtHMGR（烟草的3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因）进一步优化成功将1的产量提高到2.224 mg/g植物干重。为了解析途径中最后两个糖基转移酶AmGT11和AmGT36的确切功能，进行了另一个烟草表达实验，从中将它们摒弃。结果只产生化合物3（图4b）。当重新引入AmGT11时，观察到了生物合成中间体5的积累（图4b）。用AmGT36执行相同实验则导致4的积累（图4b）。单独存在AmGT11或AmGT36均导致中间体5和4的积累，但它们的同时表达导致1的形成表明这对在体内展示了一定程度的底物多样性（即它们各自可以接受5和4作为底物）。此外，在表达所有酶或除AmGT36外所有酶的烟草转基因体系中，还检测到了与1相同分子量的产物17（图4b），这表明17可能是烟草内源UGT催化的5的葡糖苷衍生物。Xu, B., Huang, JP., Peng, G. et al. Total biosynthesis of the medicinal triterpenoid saponin astragalosides. Nat. Plants (2024). https://doi.org/10.1038/s41477-024-01827-4
