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髓样细胞-2触发受体(TREM2)是一种髓样细胞表面受体，是多种疾病中重要的免疫信号中枢, 生理上，TREM2在有限数量的组织特异性髓样细胞中表达，包括中枢神经系统(CNS)的小胶质细胞，以维持细胞内稳态在病理条件下，TREM2与病变部位释放的许多配体结合，TREM2通路成为感知损伤和限制其扩散的核心。
越来越多的证据表明，TREM2的表达仅限于肿瘤相关巨噬细胞(TAM)和髓源性抑制细胞。抗TREM2和抗PD-1抗体的结合在几种不同的癌症中显示出有希望的效果，但TREM2是促进肿瘤还是抑制肿瘤是有争议的。考虑到TREM2在感知环境信号和引发多种下游信号传导中的作用，TREM2可能在TAM的功能重编程中起关键作用。然而，TREM2将TAM重定向到免疫抑制或防御状态的潜在机制尚未阐明。在不同的恶性肿瘤中，如何利用TREM2靶向TAM或诱导其重编程还有待进一步研究。
单细胞测序（scRNA-seq）2009年问世，2013年被《Nature Methods》评为年度技术后受到了广泛关注。scRNA-seq是针对单个细胞的转录组、基因组、表观基因组及蛋白组水平进行高通量测序分析的技术，可以检测出细胞之间的差异信息。scRNA-seq可以为肿瘤异质群体的细胞亚群分类提供依据，有效揭示肿瘤细胞内有关遗传、转录和表观遗传水平复杂性改变的过程。
2024年5月23日，中山大学张弩教授与北京大学白凡教授团队在肿瘤领域权威期刊《Cancer Cell》（IF：48.8）上在线发表题为“Distinct roles of TREM2 in central nervous system cancers and peripheral cancers”的研究论文。该研究利用单细胞测序、空间转录组学、代谢组学及多种分子生物学手段，通过体内体外实验，首次揭示了TREM2在CNS肿瘤中独特的免疫保护作用及由微环境特异因素介导的分子机制，提高TREM2表达量可显著改善机体抗肿瘤免疫的活性，为GBM等CNS肿瘤的免疫治疗提供了新的思路及策略。
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原文链接:
https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/38788719/
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首先通过小鼠脑内注射鼠源GBM细胞系(GL261和CT-2A)(图1A)建立胶质母细胞瘤（GBM）模型，发现Trem2基因敲除（Trem2-/-）小鼠植入肿瘤的生长速度明显快于野生型小鼠(图1B）。且与野生型相比，荷瘤Trem2-/-小鼠的总生存期(OS)也缩短了(图1C)。为了进一步验证TREM2在GBM中的作用，将TREM2缺陷小鼠与自发性遗传性GBM模型小鼠((Gfap-Cre; Trp53f/f; R26-MET404-flagLSL/+)杂交，并比较了这些小鼠GBM的生长情况(图1D)。与上述结果一致，spTREM2-KO小鼠比spTREM2-WT小鼠出现更大的脑瘤(图1E)，spTREM2-KO组的OS明显缩短，中位生存时间(MST)减少40天(图1F)。此外，采用药理TREM2阻断模型。给GL261-GBM小鼠注射TREM2阻断肽IA9 (图1G)。注射肽通过血脑屏障，在TME中与TREM2在细胞膜上共定位(图1H)。与此一致，IA9治疗加剧了肿瘤进展，缩短了OS(图1I-J)。这些数据揭示了TREM2对GBM进展的保护作用，而不是其在外周非中枢神经系统癌症中的肿瘤促进作用。![]()
2 TREM2缺乏在GBM TME中诱导免疫抑制的TAM腔室
为了了解TREM2对GBM进展过程中免疫景观的影响，作者采用scRNA-seq分析了野生型或Trem2-/-小鼠的正常脑组织或颅内GL261同种异体移植的免疫细胞(图2A，以下将无瘤野生型和Trem2-/-小鼠分别称为WT和KO;荷瘤野生型和Trem2-/-小鼠称为GBM和GBM KO)，共获得121701个细胞。首先关注GBM中两种主要的浸润性骨髓细胞类型(MG和MDMs)。在MG中，关注肿瘤接种后才出现的细胞亚群(TAMG，集群8)。尽管该亚群在TME中的比例在GBM组和GBM KO组之间相似(图2B)，但在转录水平上发生了显著变化，包括TREM2阻断时Arg1(TME中骨髓抑制细胞的标志)水平升高(图2C)。通路分析显示，白细胞活化和细胞因子产生显著负调控，表明TREM2缺失后抗肿瘤活性降低(图2D)。一些促炎症基因(Cst7、Cd80和Il1b) 在TREM2缺失时下调(图2E)。相比之下，除了Arg1外，其他抗炎信号(Mrc1, Msr1)在该TAM簇中显著上调(图2E)。接下来，作者研究了TREM2阻断对MDMs的影响，将MDM重新聚为12个子簇(图2F)。作者将重点放在TAMacro -脂质亚群上(集群6)。通路分析显示，上调基因富集于细胞群体增殖的负调控和固有凋亡信号通路中，下调基因富集于巨噬细胞活化和T细胞活化的正调控中(图2G)。抗炎信号(Tgfbi和Chil3)表达上调，促炎信号(Cd86和Tnfaip2)表达下调(图2E)。TREM2缺失后，单核细胞特征评分在TAMacro-脂质亚群中升高，同时巨噬细胞特征下调(图2H)，提示TREM2缺失组TME中巨噬细胞成熟阻滞，这被认为是导致抗肿瘤反应激活不足的原因。使用常规标记物的流式细胞术证实MG和MDMs增强的抗炎表型和减轻的促炎表型 (图2I-J)。表明TREM2主要通过MG和MDMs发挥其保护作用。![]()
3 骨髓细胞TREM2缺乏损害GBM中T细胞抗肿瘤活性
TME的另一个不可或缺的组成部分是淋巴细胞亚群，其中CD4+辅助性T细胞(Th)和CD8+ 细胞毒性T淋巴细胞（CTLs）在肿瘤免疫应答中起着关键作用。由于它们与髓细胞动态相互作用，于是随后检测了TREM2缺乏是否会改变T细胞景观。首先将淋巴室重新聚类为21个亚群(图3-B)。与正常脑组织(WT)相比，GBM的TME包括初始T细胞和CD4+ Th细胞数量减少，但效应细胞和耗尽的CD4+ /CD8+ T细胞数量增加(图3A)。在GBM进展过程中，T细胞亚群表现出以效应样和明显的衰竭为特征的表型(图3C)。图3D-E发现TREM2缺失组的细胞具有下调效应得分，但衰竭得分进一步提高，这表明TREM2缺失是抑制T细胞抗GBM活性的原因。细胞间通讯分析表明，TREM2缺陷导致MG亚群与T细胞之间的相互作用增强，这些T细胞表现出PDCD1-CD274、CD48-CD244、ADORA2A-NAMPT和LGASL3-MERTK对，这些对被报道参与介导抗肿瘤T细胞的衰竭(图3F)。流式细胞术分析显示Trem2-/- TME中的效应T细胞(CD44hiCD62Llo)和IFN γ+ CD8+ T细胞减少，同时耗竭的CD8+ T细胞(PD-1+和LAG-3+)显著增加(图3-H)。为了进一步验证GBM TAMs中TREM2的缺乏导致了所观察到的CTL表型，作者提取了GBM和GBM KO中的TAMs并与原代T细胞进行共培养。在抗原特异性T细胞启动试验中，TREM2缺陷的TAM在激活初始OT-1 T细胞方面不如野生型TAM熟练，这可以从增殖、效应比例和效应标记物(穿孔素/TNF-a)表达的减少中得到证明(图3I-K)。总体而言，这些结果表明，GBM TAM中TREM2缺乏导致更多的免疫抑制状态，并有助于降低CTL活性，从而导致GBM进展加快。![]()
4 单细胞和空间转录组学显示，在GBM进展过程中，骨髓成分中的TREM2下调
考虑到TREM2在肿瘤进展中的抑制作用，作者接下来想知道髓系细胞中内源性TREM2水平是否在GBM中受到影响。首先从配对的GBM样本中分选骨髓细胞(CD14+)，并对其进行qPCR(图4A)和免疫印迹分析(图4B)。与肿瘤周围细胞相比，在肿瘤髓系细胞中观察到TREM2表达减少。IBA1和TREM2的IF染色显示肿瘤区域骨髓细胞(IBA1+)明显增加，单个细胞TREM2强度减弱(图4C)。为了证实TREM2在人GBM TME中的改变，对人胶质瘤组织(T)和周围组织(P)进行了scRNA-seq(图4D)。检测到94,577个高质量细胞，并将其聚类为16个子集(图4E)。在癌组织中，骨髓亚群中TREM2表达水平明显下降(图4F-G)，在每个配对样本中都观察到这一发现(图4H)。MG和MDMs也观察到相同的模式(图4I)。与MG相比，MDMs肿瘤组TREM2下调更为明显。为了更深入地了解空间组织信息，通过空间转录组学(ST)检查了三个人类高级别胶质瘤切片(图4D)。对于每张切片，区域被分为四种不同的类型:正常，肿瘤周围，肿瘤和肿瘤核心区域(图4J)，与HE染色结果一致。在这些ST切片中，TREM2的表达分布与骨髓细胞标志物AIF1(IBA1)共定位。值得注意的是，空间轨迹分析显示，TREM2在肿瘤周围高表达，肿瘤区域TREM2表达相对较低，肿瘤核心表达水平最低(图4K-L)，与上述结果一致。使用来自TCGA、中国胶质瘤基因组图谱(CGGA)和PrognoScan的多个批量RNA-seq GBM数据集进行生存分析，基于中位截止值，未能显示TREM2高组和TREM2低组之间有任何显著差异(图4M)。相比之下，在小鼠scRNA-seq (GBM vs. GBM KO)中鉴定的TREM2缺陷TAMG中，TREM2负相关基因(TREM2-NEG，由前50个上调基因组成的高表达与来自TCGA临床数据资源(TCGA- CDR)数据集的GBM队列分析后发现，TREM2负相关基因(TREM2-NEG)与较差的OS和无进展间期(PFI)相关。支持TREM2在GBM TME中维持保护性景观。在IF染色队列中，骨髓细胞中较高的TREM2 MFI与GBM患者更好的OS相关(图40)。![]()
5 骨髓细胞中TREM2过表达抑制GBM生长并与免疫检查点阻断(ICB)治疗协同作用
考虑到GBM的进展下调了骨髓细胞中TREM2的表达，下一步研究了在TAM中升高TREM2的表达是否可以有效地阻碍GBM的发展。为了在MG和MDMs中高效过表达TREM2，利用腺相关病毒载体(AAV9 -F4/80-TREM2 flag)传递TREM2。在肿瘤接种后第3天和第10天，分别以常驻MG和浸润MDMs为靶点，向颅内注射AAV(图5A)。该AAV血清型已被证实具有向脑和MG的倾向，并能有效表达其转基因6个月以上。合并的F4/80启动子序列也确保了TREM2在MG和MDMs中的选择性过表达。在GL261和CT-2A GBM模型中，TREM2表达升高导致GBM生长受到抑制，OS延长(图5B-C)。表明维持Trem2水平对于抑制GBM进展很重要。为了研究TREM2过表达如何改变GBM的免疫景观，作者应用scRNA-seq分析了载体或AAV-TREM2处理GL261模型的TME。获得66,643个细胞并进行UMAP聚类(图5D)。在MG和MDM亚群中观察到选择性TREM2过表达(图5E)。途径分析表明，给药AAV-TREM2可上调MG和MDM亚群的炎症免疫反应，且上调项与T细胞抗肿瘤功能增强相关(图5F)。这些结果与使用典型标记的流式细胞术验证一致(图5G-H)。由于AAV特异性靶向髓系细胞室，并且在GBM TME中观察到明显的CTL衰竭(图3C)，作者想知道这种治疗是否可以与T细胞靶向ICB治疗联合使用。使用AAV-TREM2治疗小鼠，并腹腔注射抗PD-1抗体(图5I)。与AAV-TREM2单药治疗相比，联合治疗进一步抑制了肿瘤增殖，延长了OS(图5J-K)，表现出较强的协同效应。![]()
6 中枢神经系统微环境决定了TREM2在GBM中的独特作用
接下来，作者试图研究TREM2在GBM中独特功能的机制。为了确定是否与GBM内源性特征有关，向野生型和Trem2-/-小鼠脑内注射乳腺癌细胞系EO771。与GBM肿瘤类似，EO771肿瘤在Trem2-/-小鼠中表现出加速生长和更差的生存(图6A-C)。流式细胞术显示，这些小鼠的TME特征是M2样免疫抑制TAM数量增加，CD8+ T细胞耗尽，效应T细胞数量减少(图6D)。这些结果表明，肿瘤的内在特征不太可能决定TREM2在中枢神经系统癌变过程中的功能。相比之下，当GL261细胞皮下植入时，TREM2缺陷导致接种的肿瘤细胞增殖受阻(图6E-F)，TME向促炎和有效抗肿瘤状态转变，其标志是MDMs中CD206下调，但M1样标记物(iNOS和CD86)上调，CD8+ T细胞中效应标记物(IFN-γ和GZMB)上调(图6G)，与最近报道的其他非中枢神经系统肿瘤细胞系的结果相似这些发现表明，肿瘤外源性或微环境因素而不是肿瘤内在因素介导TREM2在中枢神经系统和外周癌症中的相反作用。为了探究TREM2在中枢神经系统癌症和外周肿瘤中作用的差异性原因，从GL261颅内和皮下肿瘤(ICTAM和SCTAM)中分离出CD11b+髓样细胞，并进行大量RNA测序来研究这些细胞中TREM2相关的反应。ICTAM的转录组与SCTAM的转录组明显不同(图6H)。得到了1532个显著差异表达基因(DEG)的列表(图6I)。上调的DEGs富集在与膜成分和信号转导相关的基因本体（GO）术语中，包括质膜外侧、细胞表面受体信号通路和细胞内信号转导（图6J）。TREM2-DAP10/12下游的通路项，如钙离子跨膜转运和PI3K-AKT通路也被富集(图6J)。这些结果表明，ICTAM和SCTAM之间的主要差异表现在信号传感表面和随后的信号转导途径上，表明来自微环境的配体的刺激不同。进一步的基因集富集分析(GSEA)和基因集变异分析(GSVA)均支持ICTAM与鞘脂相关通路的相关性更强(图6K)。在ICTAM中发现与鞘脂信号通路相关的几个基因(Sgpp2、Adora1和Acer2)显著上调(图6I-L)。鞘脂是一种TREM2配体，在包括癌症在内的病理状态下，在中枢神经系统微环境中高度富集。接下来，作者试图确定TREM2在中枢神经系统癌症中的特征性功能的特异性配体。![]()
7 鞘脂- TREM2信号重编程TAM进入抗肿瘤状态
TREM2作为环境变化的膜结合传感器，在与不同配体结合时介导多方面的下游信号传导。作者推测，中枢神经系统TME中富集的TREM2的未指定脂质配体可能导致不同的TREM2相关抗肿瘤反应。为了确定潜在的脂质配体，分析了从21名GBM患者和4名对照患者收集的脑脊液(CSF)代谢组学数据(图7A)。共鉴定出656种脂质代谢物(图7B)。值得注意的是，鞘脂代谢在上调代谢物的途径富集分析中脱颖而出(图7C)，与上述大量RNA-seq分析结果一致。参与鞘脂代谢的鞘磷脂(SM)和鞘脂糖(GSL)的丰度在GBM脑脊液中显著增加(图7B)。它们是肿瘤进展过程中CNS TME中常见的脂质。作者选择了这些脂质的代表性形式，并对它们进行对接分析，模拟它们与TREM2的结合。SM和GSL(GM1)都与TREM2胞外结构域2上的基本斑块吻合良好(图7D)。文献表明TREM2可以通过感知多种脂质激活SYK-PI3K-AKT信号。接下来，确定这些SM/GSLs是否在GBM TAM中以依赖TREM2的方式引发保护性信号。为此，作者从GL261 GBM中分离出TAM，并与纯化的SM和GM1孵育。SM和GM1梯度浓度处理确定的最佳浓度分别为0.2 mg/mL和0.5 mM(图7E)。SM/ GM1刺激显著下调M2样标志物CD206和ARG1，上调M1样标志物iNOS和MHC-II63(图7F)。在SM/GM1处理下，M2极化的关键调节因子p-STAT3的水平下降，而M1相关的p-STAT1的水平上升。SYK和AKT信号在巨噬细胞极化中的作用已被广泛研究。在三种AKT亚型中，AKT2与M1样极化密切相关值得注意的是，SM/GM1刺激后，磷酸化- syk和下游磷酸化- AKT2上调(图7G)。上述效应在TREM2-/-小鼠的TAM中不存在(图7F-G)，这表明SM/GM1的重编程依赖于TREM2。在从人GBM中分离的TAM中，SM/GM1刺激也导致从M2样表型向M1样表型转变(图7H和7I)。通过qPCR评估，更广泛的M2样特征基因(Cd163、Arg1、Mrc1、Stab1、Il10、F13a1和Chil3)在SM/GM1刺激下显著下调，同时M1样特征(Il12a、Il1a、Cd86和Nos2)上调(图7J)。SM/ GM1刺激的TAM对T细胞增殖的抑制作用减弱(图7K)。SM/ GM1刺激的TAM的吞噬活性显著增加(图7L)。总的来说，这些结果共同表明，富集的鞘脂能够通过TREM2将TAM引导到对抗GBM的防御状态。![]()
该研究揭示了TREM2在GBM中的保护作用，以及在GBM进展过程中浸润骨髓细胞中TREM2的下调。TREM2水平升高会阻碍GBM的进展，在癌症免疫治疗中强调了分子靶点的器官特异性重塑。该研究揭示了TREM2在CNS癌症中的独特功能及其潜在的机制线索，并揭示了恢复而不是抑制TREM2的表达可能代表了GBM的疾病特异性治疗方法。
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