结果1：RNA-seq 受试者的临床特征
研究者首先对5例以卵巢高雄激素血症为特征的PCOS女性和 5 例对照受试者的 GCs 进行了转录组测序。表1显示了接受测序分析的个体的临床信息，包括年龄、体重指数 （BMI）、月经周期长度、血清性激素水平和 FF 中的雄激素浓度。与对照组相比，PCOS 患者表现出周期长度的统计学显著延长、血清睾酮和抗苗勒管激素（AMH）水平升高、窦卵泡计数增加以及滤泡睾酮和DHEAS水平升高。除上述参数外，PCOS组和对照组之间未观察到其他检查特征的统计学显着差异。
表1 接受 RNA-seq 的参与者的临床特征
结果2：鉴定差异表达的 mRNA 和 lncRNA
按照上述差异表达基因（DEGs）和DNA编码化合物库（DELs）的选择标准，共鉴定出 684 个 mRNA，包括 408个上调和276个下调，以及 167 个 lncRNA，其中包括 97 个上调和 70 个下调，表现出统计学上显着的差异表达。DNA 编码化合物库 ( DNA encoded libraries, DELs ) 是一种与特定 DNA 序列共价连接的小分子化合物库，通过对结合化合物的 DNA 序列进行扩增和测序，可以有效地识别该化合物，从而进行快速而大规模的高通量筛选。图2A和C所示的分层聚类热图分别说明了DEG和DEL，揭示了PCOS个体和对照组个体的 GCs 之间的明显分离。这凸显了两组之间表达模式的巨大差异。此外，图 2B 和 D 中的火山图直观地描述了PCOS组和对照组之间 mRNA 和 lncRNAs 表达水平的变化。
图2 来自PCOS女性和对照的颗粒细胞的转录谱
结果3：DEGs 和 DELs 的功能富集分析
接下来研究者为了阐明与 DEGs 相关的生物学功能和关键信号通路，进行了GO和KEGG分析。DEGs 的前10个显著富集的 GO 术语显示在图3A-C中，并分为三组：生物过程（BP）、分子功能（MF）和细胞成分（CC）。在 BP 类别中，大多数 DEGs 与适应性免疫反应、细胞粘附调节、细胞外基质组织和细胞趋化性有关。在 MF 类别中，丰富的术语包括信号受体调节活性、免疫受体活性、细胞因子活性、细胞因子受体活性、G 蛋白偶联趋化因子受体活性、趋化因子受体活性和碳水化合物结合。图 3D 说明了通过基因比率测量的前 10 种富集 KEGG 通路，突出了DEG与造血细胞谱系、细胞因子-细胞因子受体相互作用、吞噬体形成、ECM 受体相互作用、病毒蛋白与细胞因子和细胞因子受体的相互作用、补体和凝血级联反应以及原发性免疫缺陷的显著关联。
图3 PCOS与对照组之间 DEGs 和 DELs 的 GO 和 KEGG 通路分析
为了深入了解 DELs 的作用和潜在机制，对DELs的顺式靶基因采用了 GO 和KEGG分析，反映了用于DEGs功能富集分析的方法。共鉴定出 113 个 DELs 的顺式靶标 mRNA。GO 分析表明，这些DELs 顺式靶基因与细胞杀伤、白细胞介导的细胞毒性、T 细胞介导的细胞毒性以及抗原加工和呈递的调节显著相关，如图 3EG 所示。此外，KEGG 分析结果（图 3H）表明，DELs 的推定顺式靶基因主要参与细胞因子-细胞因子受体相互作用途径、阿米巴病和类风湿性关节炎，这也印证了近年来PCOS被认为是一种促炎性疾病，慢性低度炎症被确定为其发病机制的重要因素。
结果4：PPI 网络构建和枢纽基因筛选
使用STRING数据库构建了一个由684个 DEGs 编码的蛋白质组成的相互作用网络。去除孤立的节点后，PPI网络由541个节点和3059个边缘组成，使用Cytoscape 进行可视化（图 4A）。为了识别该网络中的关键节点，通过 CytoHubba 插件使用多种算法（包括MCC、EPC、Closeness 和 Degree）确定了前20个节点基因。这些排名靠前的节点的交集导致选择了11个候选枢纽基因：CCR7、CD163、CD19、CD33、CD4、CD8A、CSF1R、FCGR1A、FCGR3A、IL10 和 IL7R（图 4B）。使用ClueGO 插件对这11个候选枢纽基因进行功能分析，揭示了它们与免疫和炎症调节的复杂关联。值得注意的是，这些关联包括通过 JAK-STAT 对受体信号通路的正向调节、几种炎症因子产生的调节、成熟 B 细胞和单核细胞分化的调节以及参与对抗原刺激的炎症反应（图 4C）。
图 4 PCOS中候选枢纽基因的筛选
结果5：通过机器学习选择候选枢纽基因
机器学习方法显著增强了不同组学数据的整合和分析，从而促进了用于疾病预测、患者分层和精准医学的新型生物标志物的识别。在本研究中，该研究采用机器学习算法来确定与PCOS相关的枢纽基因，从而确定CCR7为该枢纽基因。****应用 Lasso 回归、 RF 和 SVM-RFE 算法从最初确定的 11 个候选基因中细化最有前途的中心基因的选择。如图 4D 所示，LASSO 回归算法产生了四个具有最低二名词偏差的潜在枢纽基因。随后，使用 RF 分类器分析了 11 个基因集，该分类器根据基因的重要性分数对基因进行排名，如图 4E 所示。通过应用重要性的筛选阈值 0.9，确定了 9 个基因的子集。如图 4F 所示，SVM-RFE 算法揭示了 7 个基因，具有最佳的 5 倍 CV 准确度和最低的 5 倍 CV 误差。对三种算法的结果进行交叉分析，鉴定出 3 个候选枢纽基因：CCR7、FCGR3A 和 IL10（图 4G）。
结果6：枢纽基因的性能评估
研究者对CCR7的鉴定突出了它在PCOS的发病机制和诊断中的潜在关键作用。单独的箱线图（图 5A）说明了 RNA-seq 受试者中CCR7、 FCGR3A 和 IL10 的表达水平。值得注意的是，CCR7 在PCOS组中的表达水平显著升高，而 FCGR3A 和 IL10 的表达水平在同一队列中降低。为了证实这些发现，使用了两个额外的数据集：GSE65746（5名PCOS患者和5名对照者卵丘细胞中的 mRNA 和 lncRNA)和 GSE34526（7名PCOS患者和3名对照者的GC中的 mRNA)。在GSE65746数据集中，CCR7在PCOS患者中表现出显著上调，而 FCGR3A 和IL10在PCOS组和对照组之间表现出相当的表达水平（图 5B）。同样，在 GSE34526 中，PCOS 患者的CCR7上调，而 IL10 下调，FCGR3A 表达在两个队列之间保持相似（图 5C）。为了评估CCR7在PCOS中的诊断潜力，该研究进行了 ROC 分析。在队列 1 中，CCR7的AUC为 0.840（95 % CI：0.5168-1）（图 5D），在 GSE65746和GSE34526的组合队列中增加到 0.917 （95 % CI：0.7836-1） （图 5E）。在队列 2 中进一步验证了CCR7在PCOS女性 GCs 中的表达升高，该队列由 40 名PCOS女性和 40 名对照组成（图 5F）。该研究根据高雄激素血症 （血清雄激素水平 >2.6 nmol/L） 的存在将PCOS分为高雄激素PCOS和正常雄激素 PCOS，发现CCR7在正常雄激素和高雄激素PCOS组中均显著升高，高雄激素组的增加更为明显（补充图 S1A）。Spearman 相关分析显示CCR7表达与血清睾酮水平呈正相关 （r = 0.321，p = 0.043，图 5G），与月经周期长度呈负相关（r = -0.324，p = 0.041，补充图 S1B ）。在CCR7表达与血清 FSH/LH 或 BMI 之间未观察到显著关联。队列2中的ROC分析显示AUC 为0.814（95 % CI：0.7213–0.9075）（图 5H）。
CCR7 是一种 G 蛋白偶联受体，在各种细胞类型中表达，包括双阴性和单阳性胸腺细胞、初始和记忆 T 细胞、调节性 T 细胞、初始 B 细胞CD56CD16+−调节性 NK 细胞、半成熟和完全成熟的 DC 以及少数肿瘤细胞。它的两个已建立的高亲和力配体趋化因子配体21（CCL21）和趋化因子配体19（CCL19）驱动细胞在组织内的迁移。CCR7轴在癌症中起着复杂的作用，促进免疫细胞浸润到肿瘤中，同时还有助于肿瘤细胞扩散到淋巴系统，从而促进转移和癌症进展。虽然CCR7响应炎症的上调已得到充分证实，但其在PCOS中的作用仍未得到探索。在前列腺癌（一种雄激素依赖性疾病）的背景下，据报道，CCR7变异是与肥胖男性高级别前列腺癌风险相关的重要因素，并且CCR7可能介导肿瘤坏死因子-α（TNF-α）诱导的前列腺癌淋巴转移，表明CCR7与雄激素之间可能存在联系。值得注意的是，据报道，CCR7 会导致慢性炎症、肥胖和胰岛素抵抗。Ccr7 缺陷小鼠受到保护，免受饮食诱导的肥胖和胰岛素抵抗，与该研究的 GSEA 结果一致，即肥胖相关通路在CCR7表达高的PCOS女性中富集。该研究的研究结果显示PCOS女性颗粒细胞中CCR7上调，并确定CCR7是PCOS的一个有前途的诊断生物标志物。鉴于肥胖和胰岛素抵抗是PCOS的关键特征，CCR7可能与这些疾病相关，从而参与PCOS的发病机制。有必要进一步探索CCR7 在PCOS病理生理学中的机制参与，以阐明其在这种情况下的作用和治疗意义。
图 5 三个候选枢纽基因的选择和验证
结果7：ceRNA 网络的构建
ceRNA 网络因其在调节基因表达中的关键作用而近年来引起了广泛关注。因此，该研究构建了一个涉及miRNA、 lncRNAs和mRNA的竞争性调控网络。使用三个不同的在线 miRNA数据库来预测调节CCR7活性的miRNA。然后将来自这三种算法的重叠预测miRNA与GSE84376中鉴定的差异表达miRNA相交（图 6A）。结果，获得了 3 个靶向CCR7 的miRNA，包括has-let-7c-5p 、 has-miR-320d和has-miR-4286。为了进一步描述调控环境，该研究使用 LncBase v2 检查了与上述miRNA相互作用的lncRNA。鉴于lncRNAs与miRNA 在 mRNA 调控中的竞争性结合，lncRNA必须表现出与其靶基因一致的表达模式。因此，该研究将LncBase v2 预测的lncRNA与在该研究的RNA-seq分析中发现的上调的DELs相交（图 6B）。该过程产生了3个、6个和4个分别靶向 has-let-7c-5p、hsa-miR-320d和hsa-miR-4286的lncRNA。最终，使用 Cytoscape 软件，该研究构建了ceRNA 网络，其中包括 3 个 miRNA、11个lncRNA 和1 个mRNA（图 6C）。
图 6 ceRNA 网络的构建
结果8：免疫细胞浸润分析
DEGs和DELs的功能富集分析显示PCOS个体免疫反应通路显著富集。在此，使用CIBERSORT分析PCOS女性与对照组之间的免疫细胞丰度。每组的条形图中描绘了22种不同免疫细胞类型的相对比例（图7A）。值得注意的是，图形表示表明，很大一部分免疫细胞由CD4记忆静息 T 细胞和单核细胞组成，合计约占免疫细胞总数的 50%。PCOS组和对照组之间的比较分析显示，PCOS 队列中单核细胞丰度在统计学上显着降低（图7B）。此外，还探讨了CCR7与免疫细胞之间的关系。如图 7C所示，CCR7 的表达与初始B细胞呈正相关 （r = 0.684，p = 0.029）。一些局限性。首先，在促性腺激素刺激和促排卵诱导后获得所使用的GCs，导致黄体化GCs。虽然这种方法很常见，但重要的是要认识到黄体化GC的转录模式可能与卵泡期GC的转录模式不同。目前，可行性限制排除了非黄体化GC的收集。尽管如此，可以在患有PCOS的女性和对照组之间进行转录组学比较，因为她们的卵巢刺激方案具有可比性。其次，测序的样本量相对较小，需要额外的样本来对结果进行稳健的验证。此外，尽管进行了全面的生物信息学分析，但该研究没有进行进一步的实验来验证高雄激素血症对PCOS卵巢免疫微环境的影响。因此，高雄激素血症调节PCOS免疫反应的特定机制值得在体内和体外进一步探索，这将是该研究后续研究的重点。
图 7 免疫细胞浸润分析
该研究揭示了卵巢高雄激素血症的PCOS女性GCs转录谱与对照组相比存在显着差异。DEGs和DELs的功能富集分析强调了在免疫和炎症反应中的重要作用。将CCR7鉴定为PCOS中的枢纽基因及其对诊断和治疗的影响，代表了这项研究的一个关键发现。此外，该研究开发了一个以CCR7为中心的调节性 ceRNA 网络。这项研究显着增强了该研究对PCOS中雄激素过多症和免疫失调之间复杂相互作用的理解，为未来的研究工作和靶向治疗策略的开发奠定了坚实的基础。
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