肝细胞癌（hepatellular carcinoma，HCC）是原发性肝癌最常见的类型之一，占全世界肝癌病例的80%以上。HCC具有高发病率和死亡率的特点，且发病率和死亡率不断上升。DNA n6 -甲基腺嘌呤（n6 - methylladenine, 6 mA）是在真核细胞中发现的一种新型DNA甲基化。然而，其在肝细胞癌（HCC）中的改变和基因组分布特征仍然难以捉摸。在本研究中，研究者发现N6AMT1过表达可提高HCC细胞活力，抑制细胞凋亡，增强细胞迁移和侵袭，而ALKBH1过表达则相反。共价DNA修饰最近被证明与癌症的发展密切相关。2022年5月2日，中山大学团队在Genomics杂志上发表题为“DNA N6-methyladenine involvement and regulation of hepatocellular carcinoma development”的文章。本研究的生物信息学分析揭示了6 mA在邻近正常肝组织和HCC组织基因组中分布的一般特征，以及6 mA调节HCC细胞的活力、凋亡、迁移和侵袭。进一步研究这些新发现的与6 mA相关的基因可能为肝脏生理学和肝癌发病机制提供新的见解。![]()
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原文链接:https://doi.org/10.1016/j.ygeno.2022.01.002
▷▷ 结果1：肝癌中6mA修饰水平升高
首先，为了研究6 mA修饰在HCC发展过程中的潜在作用，研究者采用点印迹法比较了6例肝癌患者手术切除后肝癌癌组织和邻近正常肝组织中的6 mA水平。可以观察到，与相应相邻非癌性肝组织相比，HCC癌组织中总6 mA修饰水平显著升高（图1A）。图B是，这些HCC细胞系中，测定的相当水平的6 mA修饰和没被修饰的腺嘌呤百分比（图1B）。与正常L02肝细胞相比，癌细胞表现出更多的DNA 6 mA修饰和6 mA/A百分比。为了进一步验证，使用特异性针对6 mA的抗体，通过免疫荧光测定了7种肝癌细胞系中6 mA的水平。与正常L02肝细胞系相比，肝细胞系中总6 mA水平明显升高（图1C）。HCC组织和培养的肝癌细胞中6 mA水平的显著改变表明，6 mA修饰可能在HCC的发生和发展中起关键作用。![]()
图1 肝细胞癌中6 mA修饰的积累
▷▷ 结果2：肝癌组织和细胞系中6mA调节酶的改变
为了探索介导HCC中6 mA谱改变的生化机制，研究者测量了N6AMT1 （N-6腺嘌呤特异性DNA甲基转移酶1）和ALKBH1 （AlkB同源物1）的表达，这两种酶在人类基因组DNA中负责催化6 mA和N6-去甲基腺嘌呤反应。研究者观察到，与邻近肝组织相比，人类HCC组织中N6AMT1 mRNA表达显著上调，ALKBH1 mRNA表达下调（图2A和B），结果与DNA 6 mA水平升高一致。western blot分析也从蛋白水平上反映了这一结果（图2C）。在肝癌细胞中，除Huh-7外，N6AMT1的表达在肝癌细胞系中也显著升高，而ALKBH1的表达则显著降低（图2D和E）。western blot分析结果显示，ALKBH1显著降低，N6 mAT1显著升高（图2F）。以上结果表明，HCC组织和细胞系中N6AMT1和ALKBH1表达的显著变化进一步支持了HCC发展过程中6 mA谱的改变。![]()
图2 改变HCC组织和细胞系中两种关键6 mA酶的表达▷▷ 结果3：6mA调节酶调节HCC细胞功能
为了进一步验证6 mA修饰在HCC发生和进展中的作用，研究者使用lv003介导的基因表达系统来改变了HepG2和MHCC97H细胞系中N6AMT1和ALKBH1的表达水平（图3A），选择这两种细胞系是因为都有高水平的6 mA修饰和调节酶表达。那么两种6mA调节酶的过表达势必影响了DNA 6 mA水平。如图B所示，与对照组相比，N6AMT1过表达增强了DNA 6 mA，而ALKBH5过表达降低了DNA 6 mA。重要的是，在图C中，可以观察到这两种细胞系的细胞活力都因N6AMT1过表达而升高，而因ALKBH1过表达而降低。此外，在图D中，可以观察到N6AMT1基因过表达显著抑制HCC细胞凋亡，而ALKBH1过表达导致HCC细胞凋亡明显增加。此外，研究者发现ALKBH1基因过表达抑制了HCC细胞的迁移和侵袭，N6AMT1过表达增强了HCC细胞的迁移和侵袭（图3E）。总体而言，ALKBH1过表达降低DNA 6 mA，抑制细胞增殖，促进细胞凋亡，抑制细胞迁移和侵袭。相反，N6AMT1过表达增加DNA 6 mA，促进细胞增殖，抑制细胞凋亡，增强细胞迁移和侵袭。这些结果表明，改变这两种调控酶的表达水平，实质上调节了HCC细胞中与肿瘤发生密切相关的多种细胞过程。![]()
图 3 ALKBH1或N6AMT1过表达后细胞功能发生变化
▷▷ 结果4：6mA在肝组织中的广泛分布
接下来，为了探索6 mA在肝脏和HCC发病机制中的潜在功能，采用免疫沉淀（IP）富集6 mA，结合高通量测序的方法，对5例HCC患者的肝癌组织和相应的邻近非癌组织中的6 mA修饰进行了全基因组鉴定。6 mA基因修饰的基因组分布揭示了邻近正常肝组织和肝癌组织之间的差异。图A，在相邻正常组织中，1、2、4号染色体的6 mA修饰频率最高，而在肝癌组织中，1、2、3号染色体的6 mA修饰频率最高。在功能分布方面，如图B所示，研究者计算了6 mA在不同区域的百分比。大多数修饰发生在邻近正常组织和癌组织的基因间区域。对于折叠富集与预期分析，结果一致表明，在两种类型的组织中，与其他区域相比，基因间隔区域含有更高频率的6 mA修饰。然后对两种组织类型的6 mA修饰的共同基序进行了总结，结果表明相邻正常组织和癌组织的基序略有不同（图4C）。在邻近组织和癌旁组织中，DNA均被6 mA修饰，但6 mA富集的DNA区域不同。
图4 6mA修饰在肝组织中广泛分布▷▷ 结果5：HCC中6mA谱的改变
为了显著识别HCC发展过程中肝组织中的各种6 mA动态区域，研究者使用DESeq2比较HCC组织与相应邻近非癌组织之间的6 mA读取密度。差异修饰区（P < 0.05或0.67 < |FC| > 1.5）被认为是差异显著的6 mA修饰区。如图A所示，与相应的邻近非癌组织相比，研究者在HCC组织中鉴定出23,779个6 mA增加区域和11,240个6 mA缺失区域。HCC组织中发现大量的6 mA修饰区，表明肝组织中6 mA修饰谱的动态改变可能在HCC发病中起重要作用。那么6 mA修饰区总结在染色体圆图中，如图B所示，内圈和外圈分别表示癌变组织和邻近正常组织的6 mA修饰区的差异增益和损失。可以看出，两种组织类型的位置和频率不同。研究者的基因组关联分析显示，HCC组织中的差异6 mA修饰区分布在各种人类染色体中，在特定染色体之间存在显著差异，这表明6 mA修饰在不同染色体中可能具有不同的作用（图5B）。此外，研究者对HCC组织中增加和减少6 mA区域进行了基因组注释，并将结果与邻近正常肝组织的结果进行了比较。研究者观察到，HCC组织中大多数增加和减少6 mA的区域一致发生在基因的基因间区域，其次是内含子、外显子、非翻译区（UTR）和启动子区域。与预期值相比的倍数变化表明，HCC组织中获得-6 mA和损失-6 mA区域在基因间区表现出最高的富集（图5C2）。此外，随后对HCC组织6 mA区域的基因间元件的全基因组分析显示，如图D1所示，大多数与LINE元件相关，其次是短穿插核元件、长末端重复序列、简单重复序列、基因间区域和增强区域（图5D1）。根据与期望值的倍数变化，研究者观察到，在HCC组织的基因间区域中，获得-6 mA区域显著富集，而损失-6 mA区域主要富集在简单重复区域（图5D2）。6 mA区域在不同基因间元素的富集差异也表明6 mA区域在调控基因间元素的生物学功能中具有不同的作用。为了进一步探讨6 mA修饰在HCC发生中的作用，研究者广泛分析了HCC组织中差异修饰的6 mA区域对肿瘤发生相关基因的影响。研究者观察到，在人类基因组中与肿瘤发生相关的所有基因中，与邻近正常肝组织相比，HCC组织中7.67%被富集6 mA差异修饰，6.82%被缺失6 mA修饰（图5E1）。具体而言，肿瘤发生与32个癌基因、27个TSG基因和8个同时具有癌基因和TSG功能的基因的6 mA修饰上调有关，而在28个癌基因、30个TSG基因和9个同时具有癌基因和TSG功能的基因中观察到6 mA修饰下调（图5E2）。癌基因和TSG基因的差异6 mA修饰表明，在HCC进展过程中，DNA 6 mA修饰调控了一个复杂的基因表达网络。接下来，研究者使用GO分析揭示了通过增加和减少6 mA鉴定出的与基因相关的最常见功能。F图是与6 mA的获得和损失相关的最常见的基因功能包括单生物细胞过程、细胞过程、细胞部分等。在细胞增殖过程中，研究者观察到6 mA的增加和减少对细胞增殖有显著影响。然而，6 mA的增加主要影响参与细胞增殖负调控的基因，而n6 -甲基腺嘌呤的缺失则影响参与细胞增殖正调控的基因（图5G）。细胞凋亡过程中最重要的过程包括凋亡执行阶段和凋亡执行阶段的细胞组分分解，受6 mA的增益和损失的调节（图5H）。以上结果表明，6 mA修饰DNA可能调控肿瘤相关基因的表达，影响肿瘤细胞的增殖和凋亡。![]()
图5 HCC组织中6 mA的差异修饰和基因组注释
▷▷ 结果6：RNA-seq检测HCC细胞系中N6AMT1和ALKBH5过表达对功能基因表达的影响
为了进一步了解DNA 6 mA修饰对基因表达的调控作用，研究者建立了过表达N6AMT1和ALKBH1的HepG2和HMCC97-H细胞的基因表达谱。火山图用于总结与差异表达相关的基因（图6A），左边绿色图标表示下LV003组织细胞相对于N6AMT1组织表达水平下调的基因，右边红色图标表示相对上调的基因，纵坐标上越大，代表差异越显著。聚类图如图6B所示，红色代表基因表达水平高，蓝色代表基因表达水平低，横轴为不同的实验条件或样本，纵轴表示不同的基因。表达模式相似的基因可能具有相似的功能，共同参与同一代谢过程或存在于同一细胞通路中，因此，将表达模式相同或相近的基因聚集成类，可以用于推测未知基因的功能或已知基因的新功能。结果表明，N6AMT1和ALKBH1过表达后表达谱不同，表明DNA 6 mA修饰减弱了基因表达。对差异表达基因的鉴定进行了综述。筛选了两种细胞系中常见的基因，并对其染色体分布进行了分析。与N6AMT1过表达相关的常见差异表达基因多位于1号染色体上，而与ALKBH1过表达相关的差异表达基因多位于1、3、10号染色体上（图6C）。对常见基因进行GO分析，发现N6AMT1和ALKBH1过表达都有相似的富集趋势（图6D）。这些结果表明，DNA的6 mA修饰改变了基因的转录。![]()
图6 RNA-seq检测N6AMT1和ALKBH5过表达改变HCC细胞系中功能基因的表达
▷▷ 结果7：验证候选基因与ALKBH1或N6AMT1过表达后6mA变化相关
在相应的DNA 6 mA水平和表达水平之间交叉分析共同表达基因和差异表达基因。与DNA 6 mA增强或丧失呈正相关或负相关的基因在图中突出显示（图7A）。BCL2是一种抑制细胞凋亡、促进细胞发育的抗凋亡因子。PARTICLE是一种影响MAT2A基因启动子的lncRNA。通过qPCR验证基因表达。结果显示，N6AMT1过表达导致BCL2在两种细胞系中下调，而PARTICL在两种细胞系中因ALKBH1过表达而上调。剩余候选基因的结果与测序结果不一致（图7B）。6 mA免疫沉淀结合随后的qPCR结果显示，ALKBH1过表达显著降低了PARTICL DNA的6 mA修饰（图7C）。因此，DNA 6 mA可使BCL2和PARTICL的表达减弱。图7 验证与ALKBH1或N6AMT1过表达后DNA 6 mA变化相关的候选基因
本研究使用生物信息学分析方法揭示了6 mA在邻近正常肝组织和HCC组织基因组中分布的一般特征，包括新的基因组分布模式和功能注释，其调节HCC细胞的活力、凋亡、迁移和侵袭。例如，相邻正常肝组织和癌组织中的6 mA区域在基因间区持续且相当丰富，其次是启动子区。这表明通过在特定功能基因间区和基因启动子中获得6 mA来调控基因表达参与HCC的发病机制。然而，两种肝组织类型的修饰基序表现出差异，表明与DNA 6 mA相关的HCC发展机制可能不同。进一步研究这些新发现的与6 mA相关的基因可能为肝脏生理学和肝癌发病机制提供新的见解。
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