近年来，液体活检技术发展备受关注，其相对于常规组织活检技术具有侵入性小、快速便捷、可重复性高等优点，因此在癌症的早筛、早诊等方面产生了诸多突破性进展。它通过分析血液或尿液等中的生物标记物，如比较热门的循环肿瘤DNA（ctDNA）来检测癌症的存在。然而，由于ctDNA仅能检测DNA，且会受到其它因素污染，因此对循环肿瘤细胞（CTCs）如RNA和蛋白质的分析变得越来越重要（如图1），而随着代谢组学的发展，越来越多的代谢物标志物被认为是潜在的反映癌症发生的敏感标记物。从血液中分离出活的CTCs，将其进行浓缩，并了解培养癌细胞的培养基中所含微量代谢物的变化，可为液体活检研究做出重大贡献。
图1 液体活检研究目标概述
利用气相色谱质谱联用（GC-MS）的方法即可以对培养基中的初级代谢物进行分析，然而GC-MS对于代谢物的快速筛查及代谢通路研究方面仍存在一定挑战，为了克服这些挑战，岛津针对代谢物分析开发了专用的GC-MS数据库（Smart Metabolites Database），其涵盖600多种化合物的质谱图、保留指数、MRM离子对等信息，可在无标准品的情况下快速排除干扰组分轻松实现样品中代谢物的快速筛查。
本应用即利用岛津GCMS-TQ8040 NX和Smart Metabolites Database Ver.2在23分钟内就完成了两种CTCs样品(H358和H1975肺癌细胞)中500多种代谢组分的同时测定。这两种CTCs通过智能活检细胞分离器（Smart Biopay Cell Isolator）分离获得，并分别在0、1、10、50和100个细胞的独立培养基中培养。智能活检细胞分离器采用基于重力过滤的HDM技术，通过特殊涂层更大限度地提高回收率，每个样品均以高通量的方式在25分钟内分离活CTCs。然后使用eMSTAT Solution Ver.2和多组学分析方法包进行统计分析，通过可视化的方法呈现ANOVA（方差分析）和代谢通路图的结果，进而了解CTC数量与代谢通路上的代谢物之间的相关性。
利用ANOVA进行代谢通路分析
下图2中通过ANOVA计算未使用的培养基（含0个癌症细胞的培养基，蓝色）、含有50/100个H358肺癌细胞的培养基（红色）和含有50/100个H1975肺癌细胞（黄色）的培养基的p值，并将p值在5%及以下的代谢物投影到多组学分析方法包的代谢物通路图上。
可以看出，在H358培养基中，甘油酯代谢通路上游区域的底物（二羟丙酮磷酸和甘油磷酸酯)水平特别低，甲基乙二醛是二羟丙酮磷酸的副产物，由于糖酵解的增加，癌细胞倾向于产生甲基乙二醛作为副产物。
图2 使用eMSTAT Soutions Ver.2进行ANOVA，并将结果投影到多组学分析方法包的代谢通路图上
CTC数量与代谢通路上的代谢物的相关性分析
利用多组学方法包的代谢通路分析功能，进行CTC数量（0、1、10、50、100）与代谢物之间的相关性分析（如图3）。结果显示，色氨酸通路中的中间代谢物多巴胺与H358呈正相关（据了解肺癌患者血浆中的多巴胺水平明显高于健康受试者，其因果关系有望在以后的研究中得到阐明）。此外，在甘油三酯合成通路中，甘油磷酸酯与H358细胞数量呈正相关，众所周知，将甘油磷酸酯转化为1,3-二磷酸甘油酸的甘油醛-3-磷酸脱氢酶（NADP+）在肺癌细胞中高表达。因此，本实验中甘油磷酸酯的减少也被认为是由于甘油醛-3-磷酸脱氢酶（NADP+）的增加。
图3 搜索与CTC计数相关的代谢物
结论
通过GC-MS和智能代谢物数据库分析培养了癌症细胞的培养基中代谢物的情况，并结合多组学方法包的代谢通路分析功能，分析CTC数量与代谢物之间的相关性，将有助于液体活检相关的方法研究。
代谢物数据库特点
• 超过600种代谢化合物信息，提供氨基酸、脂肪酸和糖的专用分析方法，轻松实现代谢物泛范围筛查。
• 代谢物MRM信息数据库，无需标准品即可快速创建高灵敏度分析方法
• 新增糖专用分析方法和功能性成分化合物信息扩展样品分析范围
• 新增过滤功能，允许用户只选择和分析给定样品中可能被检测到的代谢物，节省分析时间和劳动力
• “代谢组学手册”全方位说明从样品准备到多变量分析的每个步骤，即使是初学者亦可以轻松应对。
实验仪器
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