液体活检是指通过微创或无创的方式收集血液或其他体液（包括尿液、腹水、胸腔积液等），并对其中肿瘤相关的物质进行分析的一种检验方式。以血液为例，除了正常的红细胞、白细胞、来自正常细胞的游离 DNA (cell free DNA, cfDNA)，还可以检测到一些来自肿瘤的物质，包括循环肿瘤细胞 (Circulating Tumor Cell, CTC)、循环肿瘤 DNA (Circulating Tumor DNA, ctDNA)。需要指出的是，cfDNA 可以来自正常细胞和肿瘤细胞，ctDNA 特指来自肿瘤的游离 DNA。
液体活检，特别是对cfDNA的分析，已经成为肿瘤学中一种具有广阔应用前景的非侵入性诊断方法。ctDNA甲基化可在肿瘤发生的早期被检测到，而且具有较好的稳定性，因此ctDNA甲基化成为肿瘤液体活检中一个极具价值的标志物。目前正在开发cfDNA甲基化图谱的系统分析，用于癌症的早期发现、微小残留病(MRD)的监测、预测治疗效果和预后、追踪组织来源等。本文综述了ctDNA图谱在早期癌症非侵入性诊断中的优缺点，并探讨了ctDNA甲基化检测在临床应用中的最新进展。还总结了用于ctDNA甲基化分析的技术，并简要概述了用于分析DNA甲基化测序数据的生物信息学方法。
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下面将从cfDNA和ctDNA的基本概念、ctDNA甲基化检测技术、DNA甲基化数据分析模式以及ctDNA甲基化的临床应用这四个方面进行简要概述。
01
什么是cfDNA和ctDNA？
cfDNA（cell free DNA）是指细胞游离DNA，通过细胞凋亡、坏死和分泌释放到血液中(图1)。cfDNA通常是双链片段，长度约为150-200个碱基对。ctDNA的分子遗传和表观遗传信息可以反映出起源细胞的基因组或表观基因组。健康成年人的cfDNA浓度一般很低，通常不到每毫升血浆10微克。
在癌症患者中，总cfDNA的某些成分是由肿瘤细胞释放的，称为ctDNA (Circulating Tumor DNA)。ctDNA在整个cfDNA背景中的比例变化很大，从0.05%到90%不等。影响ctDNA浓度的因素很多，包括肿瘤的体积、定位和血运、抗肿瘤治疗(如手术、化疗、放疗等)，以及肝和肾的清除作用。据报道，ctDNA的半衰期为16分钟到2.5小时，这使得ctDNA分析可以作为肿瘤情况的“实时快照”。ctDNA在膀胱癌、结直肠癌和卵巢癌等癌症类型中几乎可以100%被检测到，并且在其他大多数癌症类型中也有超过50%的概率可以被检测到，不过在胶质瘤中只有10%的病例中可以检测到ctDNA。同时，血浆中ctDNA浓度和可检测到ctDNA水平也被证明与肿瘤分期有关。
图1
02
ctDNA甲基化检测技术
在将ctDNA甲基化分析应用于临床之前，需要解决的关键问题之一是检测技术，它必须具有高灵敏度、成本效益和测序覆盖率高的特点，特别是对于非常微量的ctDNA。目前，已经开发了许多检测ctDNA甲基化的方法(图2)，大致可分为两类：基于重亚硫酸盐转化的方法和非重亚硫酸盐转化方法。表1选择性地列出了当前主要检测方法的优缺点和对cfDNA起始量的需求。
图2
其中，重亚硫酸盐转化方法可以分为基因组甲基化检测，代表性的方法包括全基因组甲基化测序（WGBS）和简化基因组甲基化测序（RRBS等）。如果要检测特定位点的甲基化，还可以使用靶基因重压硫酸盐测序（Target-BS）、焦磷酸测序、甲基化芯片和甲基化特异性PCR(MSP)。而不依赖于重亚硫酸盐转化的方法又可以分为基于富集的方法和基于限制性内切酶的方法。表1列出了当前主要检测方法的优缺点以及对cfDNA起始量的需求。
表1.液体活检的主要甲基化检测方法
03
DNA甲基化数据分析模式
ctDNA技术的最新发展侧重于提高测序方法的分析灵敏度，这可能会受到DNA制备过程中或测序过程中引入的错误的影响。ctDNA甲基化与常规数据分析在分析策略上没有明显差异。对于基于NGS的方法，分析程序包括质量控制(QC)、数据比对、DNA甲基化位点/甲基化峰确认、DNA甲基化定量和差异甲基化位点/区域(DMS/DMR)鉴定。结合测序文库的准备，每种测量方法对应的分析细节在某些步骤上是不同的，下面介绍常用的分析程序：
质量控制(QC)和数据比对：即对数据进行质量控制，保留高质量的数据，并将质控后的数据与人类参考基因组进行比对。
定量DNA甲基化位点/峰：对于亚硫酸氢盐测序方法，甲基化位点由比对中未改变的C位点决定，获得的每个CpG位点的甲基化水平是一个连续变量，通过使用未甲基化的C在测序的总C中的比例来计算。
差异甲基化位点/区域(DMS/DMR)鉴定：在进行回归分析时，可以添加协变量校正以消除混杂因素的影响，如年龄和性别。在小样本量的情况下，多个相邻的CpG位点应合并到一个定义的区域，称为DMR，以提高统计性能。
癌症特异性cfDNA甲基化生物标志物的鉴定：通常的步骤是(i)获得癌症和健康cfDNA之间的DMRs；(ii)获得癌症cfDNA和外周血单核细胞(PBMC)基因组DNA的DMRs；(iii)前述DMRs的共有区域为肿瘤特异性DMRs，同时将无肿瘤PBMC的甲基化谱作为阴性对照。
04
ctDNA甲基化的临床应用场景
ctDNA甲基化在精确肿瘤学中的临床应用场景主要有以下几个方面：
癌症筛查：筛查疾病标志物，以便对无症状个体的癌症进行早期干预。
癌症检测：癌症的早期检测可以使治疗尽早开始。如果肿瘤被早期诊断，可以进行根治性手术，以提高患者的治愈率。对于有症状的患者，灵敏而特异的癌症检测可以加快诊断和治疗的时间。
微小残留病和复发监测：识别复发风险高的残留病患者，这可用于在接受辅助治疗之前对患者进行分级。有效的分级将防止低风险患者过度治疗，防止高危患者治疗不足。MRD可以比目前的方法提前几个月预测复发。
评估治疗效果：ctDNA动态与治疗反应相关，能够在临床复发前提示治疗效果。治疗监测可以确定反应或进展，使临床医生和患者能够相应地选择治疗方案。
预后价值：对进展风险的评估对于治疗策略的选择至关重要。
追踪ctDNA的组织来源：确定cfDNA的组织来源具有重大的生物学意义和潜在诊断价值。
下表列举了近期基于DNA甲基化的癌症液体活检研究的部分综述，感兴趣的小伙伴也可检索文献阅读。
总体而言，ctDNA 甲基化是肿瘤早期或复发早期的重要信号，检测体液中的ctDNA 甲基化对于肿瘤的筛查、早期诊断、预后判断、复发检测、疗效评估等关键难题极具应用价值。
cfDNA甲基化检测技术瓶颈
对于cfDNA等相对微量且片段化十分严重的样本，常用甲基化检测主要包括cfMeDIP，微量WGBS技术。应用RRBS检测的CG位点极为有限，主要原因cfDNA自身就在选择片段范围之内，如果片段内CG含量高被酶切，反而更短不被富集，因此可能检测到的都是CG含量低的区域片段。
WGBS，太贵！
RRBS，位点太少！
新技术推介
为助力低样本量多维度分析，深圳市易基因科技开发了富集覆盖CpG岛、启动子、增强子、CTCF结合位点的cfDNA甲基化测序方法——cfDNA-RBS，实现了高灵敏度和样本复用，使其具有高度可扩展性，并适用于有限的样本和单个细胞。
易基因建立的cfDNA-RBS技术，仅需15-20G测序数据，DNA建库起始量低至1ng的cfDNA样本，可以检测10M有效CG位点覆盖，是目前肿瘤甲基化标志物检测研究的优选技术。
微量cfDNA简化基因组甲基化测序（cfDNA-RBS）
100ul血浆或1ng cfDNA
10M有效CG位点覆盖
15-20G测序数据量
WGBS、cfDNA-RBS、RRBS系列技术指标比较
参考文献：
https://doi.org/10.1016/j.molmed.2020.12.011
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易基因专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务。技术团队在国际上首创LHC-BS、HMST-seq、ChIP-BS、cfDNA-TBS等甲基化、羟甲基化技术流程，研发建立简化基因组甲基化dRRBS、cfDNA-RBS，单细胞/微量DNA全基因组甲基化及简化高通量甲基化测序技术，RNA甲基化测序等技术和方法，并建立易基因科技全自动化弹性资源生信分析系统。在Nature、Cell、Lancet、Science、Nat Commun、 Cell Res、Genome Biol、Blood、PloS Genet、Epigenetics、Epigenomics 、Clin Epigenetic等著名期刊发表论文100余篇，申请发明专利14项、软件著作权29项。
