癌症是美国1~14岁儿童第二大常见死因，每年约有11000例新发病例和1200例死亡病例。与成人癌症相比，儿童肿瘤通常突变负荷较低。然而儿童肿瘤的表观基因组发生显著变化，尤其具有广泛的DNA甲基化变化。儿童肿瘤的罕见性对开发用于诊断、预后或治疗监测的癌症特异性生物标志物带来了重大挑战。
美国南加州大学Keck医学院转化基因组系Bodour Salhia团队研究了各种不同儿童肿瘤的共有DNA甲基化谱的潜力。研究在11种不同儿童癌症类型的31个复发性儿童肿瘤组织、13个邻近正常组织和20个血浆游离细胞(cell-free，cf)DNA样本上进行全基因组重亚硫酸盐测序(WGBS)，定义了多种癌症类型样本间差异甲基化的最小焦点区域，称之为微小差异甲基化区域(minimally differentially methylated regions，mDMRs)。从公开数据库获取的 506 个儿童癌症样本和 5691 个成人癌症样本中也观察到这些甲基化变化，使用靶向杂交探针捕获法分析的44个儿童癌症样本中同样观察到这些甲基化变化。本研究最后表明了这些甲基化变化可在cfDNA中检测到，并可能作为早期检测或微小残留疾病的潜在cfDNA甲基化生物标志物。相关研究成果于2024年6月1日以“A comprehensive analysis of minimally differentially methylated regions common to pediatric and adult solid tumors”为题发表在《npj Precision Oncology》（IF 6.8）期刊上。
测序分析：对儿童癌症进行WGBS测序分析（包括来自27名个体的31个肿瘤组织、13个正常组织和20个cfDNA样本，涵盖11种不同的儿童癌症亚型）
数据整合：通过不同肿瘤类型的数据整合，鉴定在多种癌症类型中样本数量最多的微小差异甲基化区域（mDMRs）。
下游验证：
（1）mDMRs 在TARGET公开数据库中的506个儿童癌症样本中（涵盖4种癌症类型）、
TCGA数据中的5691个成人癌症样本（涵盖14种癌症类型）、Capper等人的几种中枢神经系统肿瘤类型中均观察到。
（2）使用靶向杂交探针捕获检测法在一组独立的44个儿童癌症组织样本中进行进一步验证（来自6种肿瘤类型）。
（1）分析儿童癌症的差异DNA甲基化模式
图1：儿童癌症中差异DNA甲基化模式分析
a) 31个肿瘤样本中183个高度变化的差异化甲基化区域（DMRs）的beta值分层聚类。行注释条表示诊断结果；列注释条表示通过k均值聚类确定的DMRs聚类。
b) 基于183个最高变化DMRs样本进行均匀流形近似投影（UMAP）分析，如c所示。
c) 506个TARGET项目样本中166个区域和17个POETIC项目样本中183个区域的beta值热图（A中的17个区域由于450K芯片限制而被排除）。
d) 根据诊断和来源，对C中的区域进行TARGET和POETIC样本UMAP分析。
e) 分析TARGET和POETIC样本来源。
（2）不同肿瘤类型共有的DNA甲基化变化
图2：WGBS分析揭示儿童癌症的共有DNA甲基化panel。
a) 不同数量样本（x轴）中重叠mDMRs的数量（y轴）。根据方向性，浅蓝色代表低甲基化区域，红色代表高甲基化区域。红色的虚线垂直线表示样本数量的截断点（22或更多样本，即70%肿瘤样本），由此产生402个低甲基化和503个高甲基化mDMRs。
b) 低甲基化和高甲基化mDMRs的平均beta值箱线图。
c) 根据所有POETIC样本中所有低甲基化mDMR区域的beta值热图。
d) 基于所有POETIC样本中所有低甲基化mDMR区域的beta值UMAP分析。
e) 根据所有POETIC样本中所有高甲基化mDMR区域的beta值热图。
f) 基于所有POETIC样本中所有高甲基化mDMR区域的beta值UMAP。
g) 使用mDMRs构建的随机森林分类器模型的接收者操作特征（ROC）曲线。
图3：TARGET和ENCODE数据集中的mDMR。
方框图显示了TARGET数据中MRT、NBL OS和WT肿瘤样本中高甲基化（左）和低甲基化（右）mDMR的每个样本平均β值分布。每个点代表一个样本，中位数β和四分位数间距由方框图表示。
POETIC中的正常组织和ENCODE中的正常组织作为对照；所有比较均具有统计学意义（Wilcox p值≤0.0001），与POETIC样本中观察到的方向性一致。
（3）儿童癌症的mDMR也可用于检测成人癌症
图4：TCGA数据库中多种成人癌症中检测到的mDMRs分析
a) WGBS来源的905个儿童癌症mDMRs中的422个（由于450K芯片限制，只使用422个子集）训练的随机森林模型，基于TCGA的450K DNA甲基化数据绘制的ROC曲线。
b) a中的AUC值图形，并以误差线的形式表示了95%置信区间（CI）。
c) 所有14种成人癌症类型中，高甲基化（上半部分）和低甲基化（下半部分）mDMRs的每样本肿瘤和正常组织的平均beta值箱线图。
（4）cfDNA与肿瘤组织之间甲基化模式的相关性
图5：匹配的血浆和组织样本之间重叠的DMR。
a. cfDNA的总DMR。
b. cfDNA中检测到的DMRs与患者匹配的肿瘤组织样本中检测到的DMRs重叠的百分比。
c. 患者匹配的组织和cfDNA之间相交DMRs的差异甲基化的相关性图。
（5）泛儿童癌症（pan-pediatric）中共同存在且可检测的mDMRs，且这些mDMRs可以在cfDNA中被检测到
图6：儿童癌症样本血浆mDMR的cfDNA甲基化分析。
a-b. 肿瘤样本中鉴定的402个低甲基化和503个高甲基化mDMR的cfDNA平均β值。代表了所有健康和癌症血浆样本的所有区域。
图 7：在独立的儿科癌症组织队列中对低甲基化 mDMR 进行靶向甲基化分析。
（6）在神经母细胞瘤（儿童常见实体瘤）样本中发现了广泛的特异性低甲基化区域，称为“DNA甲基化荒漠”
图8：通过全基因组亚硫酸盐测序（WGBS）技术揭示了神经母细胞瘤中两种显著的甲基化模式：DNA甲基化荒漠和经典的部分甲基化域（PMDs）
（7）WGBS在肿瘤组织gDNA中的拷贝数预估
图9：WGBS在小儿癌症组织中的拷贝数评估。
（8）cfDNA中CNV检测的灵敏度低于cfDNA甲基化
图10：cfDNA中CNVs的检测。
最终研究结果揭示了儿童肿瘤和成人肿瘤中的甲基化变化在cfDNA中可检测到，并可能作为潜在的cfDNA甲基化生物标志物。
儿童癌症DNA甲基化panel的鉴定可能为早期检测、治疗反应或微小残留疾病（MRD）的cfDNA甲基化液体活检提供基础。本研究揭示的甲基化模式既具有科学价值，也具有临床价值，旨在将这些分子见解转化为儿童和成人癌症的实际进展。
关于易基因全基因组重亚硫酸盐测序
（WGBS）技术
全基因组重亚硫酸盐甲基化测序（WGBS）可以在全基因组范围内精确的检测所有单个胞嘧啶碱基（C碱基）的甲基化水平，是DNA甲基化研究的金标准。WGBS能为基因组DNA甲基化时空特异性修饰的研究提供重要技术支持，能广泛应用在个体发育、衰老和疾病等生命过程的机制研究中，也是各物种甲基化图谱研究的首选方法。
易基因提供的全基因组甲基化测序技术通过T4-DNA连接酶，在超声波打断基因组DNA片段的两端连接接头序列，连接产物通过重亚硫酸盐处理将未甲基化修饰的胞嘧啶C转变为尿嘧啶U，进而通过接头序列介导的 PCR 技术将尿嘧啶U转变为胸腺嘧啶T。
应用方向：
WGBS广泛用于各种物种，要求全基因组扫描（不错过关键位点）
全基因组甲基化图谱课题
标志物筛选课题
小规模研究课题
技术优势：
应用范围广：适用于所有参考基因组已知物种的甲基化研究；
全基因组覆盖：最大限度地获取完整的全基因组甲基化信息，精确绘制甲基化图谱；
单碱基分辨率：可精确分析每一个C碱基的甲基化状态。
易基因提供全面的表观基因组学（DNA甲基化、DNA羟甲基化）和表观转录组学（m6A、m5C、m1A、m7G）、染色质结构与功能组学技术方案（ChIP-seq、ATAC-seq），详询易基因：0755-28317900。
参考文献：
Buckley DN, Tew BY, Gooden C, Salhia B. A comprehensive analysis of minimally differentially methylated regions common to pediatric and adult solid tumors. NPJ Precis Oncol. 2024 Jun 1;8(1):125. pii: 10.1038/s41698-024-00590-1. doi: 10.1038/s41698-024-00590-1. PubMed PMID: 38824198.
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深圳市易基因科技有限公司(简称易基因，E-GENE Co.,Ltd.)以“引领表观遗传学科学研究与临床应用”为愿景，依托高通量测序技术和云数据分析平台。为医疗机构、科研机构、企事业单位等提供以表观遗传学技术为核心的多组学科研服务及解决方案，全面覆盖针对生命科学基础研究、医学及临床应用研究等内容。
易基因专注表观组学十余年，领跑多组学科研服务。技术团队在国际上首创LHC-BS、HMST-seq、ChIP-BS、cfDNA-TBS等甲基化、羟甲基化技术流程，研发建立简化基因组甲基化dRRBS、cfDNA-RBS，单细胞/微量DNA全基因组甲基化及简化高通量甲基化测序技术，RNA甲基化测序等技术和方法，并建立易基因科技全自动化弹性资源生信分析系统。在Nature、Cell、Lancet、Science、Nat Commun、 Cell Res、Genome Biol、Blood、PloS Genet、Epigenetics、Epigenomics 、Clin Epigenetic等著名期刊发表论文100余篇，申请发明专利14项、软件著作权29项。
