网络药理学+体内外实验对中药研究也太友好了！南通大学附属医院Q1：三叶青中成分改善溃疡性结肠炎的抗炎作用机制

文章标题：Mechanism of Nicotiflorin in San-Ye-Qing rhizome for anti-inflammatory effect in ulcerative colitis

期刊名称：Phytomedicine

影响因子：6.7

发表时间：2024年7月

通讯单位：南通大学附属医院

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传统中药三叶青（Tetrastigma hemsleyanum Diels et Gilg）是草质藤本植物，具有清热解毒、祛风化痰、活血止痛等功效。研究表明，SYQ叶提取物有效抑制 DSS 诱导的结肠炎，可能通过调节 Keap1/Nrf2 信号通路和纠正肠道菌群失衡来缓解氧化应激，从而维持肠上皮屏障。但是缺少SYQ根茎的抗炎作用及其作用机制尚不清楚。

这篇文章通过鉴定SYQ根茎粉的主要成分，通过网络药理学+分子对接，找到关键靶点和通路，进行体内外药效实验验证，发现并揭示了烟花苷的抗炎作用和分子机制。

通过构建UC模型并使用SYQ根茎粉进行处理进行药效研究，使用HPLC等技术鉴定到9种关键成分，对这9种成分进行网络药理学分析和细胞毒性检测，预测并筛选关键靶点和信号通路，基于分子对接预测、CETSA、DARTS、SPR、MPO活性测定和体外实验，最终选择主要成分烟花苷和关键通路—NF-κB进行后续研究，发现烟花苷通过抑制NF-κB通路和NLRP3炎症小体的活性来发挥抗炎作用。

1、SYQ 在 UC 小鼠模型中表现出治疗作用

研究人员选取6-8周龄C57BL/6 小鼠进行UC模型构建，以5-ASA作为阳性对照药物，进行两种浓度的SYQ提取物治疗。通过小鼠体重、结肠长度、MPO活性、DAI评分等UC指标的检测，以及血清 IL-1β 、 IL-6 和 TNF-α含量的ELISA测量，发现SYQ根茎粉治疗后，小鼠的体重和MPO活性上升，DAI 评分显著降低，血清 IL-1β 、 IL-6 和 TNF-α降低，表明SYQ具有对UC的有效治疗效果（图1）。

Fig. 1. SYQ has therapeutic effects on UC in mice.

为了探讨SYQ对小鼠结肠炎模型结肠粘液屏障的影响，研究人员对小鼠结肠组织进行了HE和AB-PAS 染色并进行病理评分，结果显示SYQ处理后的UC小鼠粘蛋白水平有显著的增加，同时结肠粘液屏障的损伤也降低。通过免疫荧光，检测到UC小鼠的E-cadherin 和Occludin在施加SYQ 后表达上升（图2）。

Fig. 2. SYQ has therapeutic effects on UC in mice.

2、SYQ 粉末成分的分离和鉴定

接下来研究人员进行植物化学分析以分离和鉴定 SYQ 的主要成分，鉴定流程包括70% 乙醇回流萃取、大孔树脂吸附、不同浓度乙醇洗脱和半预HPLC，最终分离和获取了 9 种化合物（图3）。

Fig. 3. Flowchart of the isolation and identification of the components of the powder of the rhizome of SYQ.

3、SYQ 分离的 9 种化合物的网络药理学分析

使用网络药理学方法，研究人员从各数据库中检索并预测了9种分离和鉴定化合物的 310 个关键靶点；然后通过将药物相关靶点与疾病相关靶点取交集，得到185个疾病相关的共同靶点。使用STRING数据库对185个靶点进行PPI分析以及富集分析。

GO富集分析显示，这些靶标的基因功能与激酶活性、细胞因子产生、炎症反应和 I-κB 激酶/NF-κB 信号转导的正调控相关。

KEGG 富集分析表明 PI3K-Akt 信号通路、TNF 信号通路、Toll 样受体信号通路和 NF-κB 信号通路，表明这些信号通路可能是 SYQ 抗 UC 作用的原因（图4）。

Fig. 4. Network pharmacology analysis.

4、SYQ中9种分离化合物在RAW264.7细胞炎症模型中的作用

为了进一步验证和筛选从SYQ中分离的9种化合物的疗效，研究人员使用RAW264.7细胞系进行了9种化合物的药物毒性试验。

通过将 RAW264.7细胞与9种化合物中的每一种共孵育并添加LPS来构建细胞炎症模型。然后我们测量了细胞上清液中NO释放的浓度。结果表明，所有9种化合物均对NO释放表现出抑制活性（图5）。

其中，烟花苷显示出最有效的抑制活性，也是SYQ根茎粉中含量最多的成分，研究人员选择烟花苷作为后续研究的主要对象。

Fig. 5. Preliminary screening of 9 compounds for cytotoxicity and anti-inflammatory effects.

5、分子对接分析

采用分子对接分析确定烟花苷与 TLR4/MD2、p65、Caspase-1、NLRP3 和 IL-1β 5 个核心靶点的结合能，并以-5.0 kcal/mol的阈值筛选（图6）。

结果表明，烟花苷可能通过TLR4/NF-κB通路和NLRP3炎性小体的激活影响UC。

Fig. 6. Molecular docking of Nicotiflorin with TLR4, p65, Caspase-1, NLRP3, and IL-1β.

6、p65 是烟花苷的关键靶点

为研究烟花苷与NF-κB通路中的关键调节因子p65之间是否存在相互作用，研究人员进行了CETSA实验。结果表明，与对照组相比，烟花素处理的 p65 蛋白具有更好的热稳定性。同时，DARTS实验结果表明，与对照组相比，烟花苷处理蛋白中p65蛋白含量显著增加，反映了烟花苷和p65的结合。

此外，通过SPR实验检测p65和烟花苷的结合。结果显示，p65与烟花苷结合，结合Kd为47.39 nM。

最后，为了进一步探究烟花苷对p65的影响，研究人员检测了p65的酶活性。使用TransAM NF-κB p65活化测定试剂盒进行测量。结果表明，与对照组相比，烟花苷处理蛋白中p65蛋白的活性显著降低，即烟花苷对p65活性有显著的抑制作用（图7）。

Fig. 7. p65 is a Key Target of Nicotiflorin.

7、烟花苷通过抑制 NF-κB 通路和 NLRP3 炎性小体激活在体外抑制炎症

研究人员提取了小鼠的骨髓来源的巨噬细胞（BMDMs），并构建炎症模型，以研究烟花苷对 NF-κB 信号通路的影响及其对炎症反应的影响。

将模型BMDMs与 3 种不同浓度的烟花素 （25、50、100 μM） 中的每一种进行共孵育，随后检测 p65、p-p65、IκBα 和 p-IκBα 的表达水平。观察到尽管烟花苷对 NF-κB p65 和 IκBα 的表达水平没有显著影响，但它显着降低了 NF-κB p65 和 IκBα 的磷酸化。

因此，烟花素对细胞炎症的抑制作用可能是通过抑制 NF-κB 信号通路的下游实施来实现的。

后面，研究人员通过LPS和ATP刺激BMDMs，模拟NLRP3 炎性小体的激活。WB结果显示，在烟花苷处理后，上清液中的 IL-1β p17 和 Caspase-1 p20 显著降低（图8）。

Fig. 8. Nicotiflorin suppresses inflammation in vitro by inhibiting NF-κB activation and NLRP3 inflammasome activation.

研究人员通过HPLC等技术结合体内外实验，发现了一种名为烟花苷的天然化合物，来自于SYQ的根茎粉，它在抗炎领域展现出了巨大的潜力，具有治疗 UC 的治疗特性。通过网络药理学和分子对接等生信分析，找到关键的通路NF-κB和几个关键靶点，药效实验表明，烟花苷通过抑制 NF-κB 通路和 NLRP3 炎性小体的激活发挥有效的抗炎作用，为烟花苷作为潜在的抗UC治疗药物提供了有力的科学依据。

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