慢性鼻-鼻窦炎(chronic rhinosinusitis, CRS)是指持续至少12周的鼻窦和鼻腔黏膜复杂炎症性疾病。据估计，该病累及5%的人，根据有无鼻息肉，CRS分为CRS伴鼻息肉(CRS with nasal polyps, CRSwNP)和CRS不伴鼻息肉(CRS without nasal polyps, CRSsNP)。CRSwNP约占所有CRS病例的1/3，症状包括嗅觉丧失、鼻塞、鼻前或鼻后滴漏，以及面部压迫感。其特征是鼻窦粘膜发生慢性炎症，导致鼻息肉（NP）形成。
在过去十年中，在阐明CRSwNP的发病机制方面取得了相当大的进展，特别是2型免疫细胞的作用，包括2型先天性淋巴细胞（ILC2）、2型辅助性T（Th2）细胞、肥大细胞和嗜酸性粒细胞。这些发现促进了针对CRSwNP中2型炎症的生物制剂的开发，例如 dupilumab、omalizumab 和 mepolizumab。然而，大约40-60%的患者对手术干预或糖皮质激素和抗2型炎症治疗反应不佳，这表明需要更好地了解超越传统2型范式的疾病发病机制才能开发新疗法。
Visium HD由10x Genomics于2024年初推出，芯片包含两个6.5 x 6.5 mm的捕获区域，将传统Visium 平台的分辨率从55 μm提升到2 μm的水平，实现单细胞级空间分辨率。同时，传统10x Visium空间基因表达玻片上的spot是圆形的，两个spot之间存在自然形成的空隙，而Visium HD玻片将带有空间位置标签的寡核苷酸排布在连续排列的数百万个无间隙的2 x 2µm正方形中，实现了无间隙捕获组织信息。
这篇文章于2024年11月发表在Nature Communications上的文章：Granzyme K+CD8+ T cells interact with fibroblasts to promote neutrophilic inflammation in nasal polyps，通过整合scRNA-seq、scTCR-seq、空间转录组学（Visium和Visium HD）分析，揭示了NP中GZMK+CD8 T细胞的存在增加，与成纤维细胞的空间邻近关系和相互串扰，以及对NP中中性粒细胞炎症的促进。
原名：Granzyme K+CD8+ T cells interact with fibroblasts to promote neutrophilic inflammation in nasal polyps
译名：GZMK+CD8+ T细胞与成纤维细胞相互作用，促进鼻息肉中性粒细胞炎症
期刊：Nature Communications
影响因子：14.7
发表时间：2024-11-29
通讯作者：Di Yu，Zheng Liu
通讯单位：华中科技大学同济医学院，昆士兰大学医学院
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01
研究背景
基质细胞和免疫细胞之间的复杂相互作用在各种生物和病理过程中起着至关重要的作用。在慢性鼻-鼻窦炎伴鼻息肉（CRSwNP）中，许多患者的上气道炎症是由T细胞驱动的H2、ILC2 和嗜酸性粒细胞，因此用糖皮质激素和抗2型炎症生物制剂治疗。对这些疗法的耐药性通常与中性粒细胞炎症有关，这在CRSwNP中也已被广泛发现，但其潜在机制仍不清楚。
02
研究结果
1.对照参与者和CRSwNP患者之间不同的免疫细胞组成
获取8名患者的NP样本和4个对照参与者鼻中隔偏曲的下鼻甲（CIT）样本，和外周血样本（Fig 1 A）。使用流式细胞术对CD45+淋巴细胞进行分选，然后进行scRNA-seq和scTCR-seq/scBCR-seq。
UMAP降维获得25个细胞簇（Fig 1 B），根据marker基因进行注释：CD4 T（CD3D、CD3E、CD4）、CD8 T（CD3D、CD3E、CD8A、CD8B）、γδT（TRDV2、TRGV9）、NK细胞（TYROBP 、 FCGR3A、NKG7）、B细胞（CD79A、MS4A1）、ILC2s（IL7R、GATA3、PTGDR2 ））和Myeloid细胞（CD14、CD68、TPSAB1）（Fig 1 B, C）。
CD8 T是鼻组织中最丰富的细胞群（Fig 1 D）。应用Ro/e评分来评估每种细胞类型的组织偏好，CD8 T、ILC2s和Myeloid细胞在鼻组织中富集，γδT和NK细胞在CIT中富集，而ILC2s在NP中富集（Fig 1 E, F）。
Fig. 1: Distinct immune cell compositions between control participants and CRSwNP patients.
2.GZMK+CD8+T细胞在鼻息肉中增加
对CD8 T细胞亚聚类，UMAP降维获得16个细胞簇（Fig 2 A）。基于DEG、marker基因和基因特征评分，定义了9个CD8 T亚群（Fig 2 B, C）。CD8 naive T细胞（cluster 2、4和13）表现出高表达初始基因特征，包括CCR7、SELL、LEF1和TCF。CD8组织驻留记忆T细胞（TRM）（cluster 0、5、6、8和12），高表达CD69、CXCR6和ITGA1，同时细胞毒性标志物低表达。GZMB+CD8 T细胞（cluster 3和10）显著表达细胞毒性标志物，但GZMK除外，如GNLY、GZMB、GZMH、PRF1 和 NKG7，显示出细胞毒性T细胞基因特征。GZMK+CD8 T细胞（cluster 1）高表达GZMK和效应记忆T细胞基因特征，但其他颗粒酶的表达较低，这使它们与其他表达颗粒酶的CD8 T细胞区分开来。GNLY+CD8 T细胞（cluster 11）高表达GNLY；MAIT（cluster 7）高表达TRAV1-2和SLC4A10；NEAT1+CD8 T细胞（cluster 9）高表达MALAT1和NEAT1。循环CD8 T（cluster 14）高度表达增殖标志物，如MKI67、PCNA和TYMS；CD8 祖细胞耗竭细胞（CD8 Tpex）（cluster 15）高表达CCR7、TCF7和耗竭标志物（如CTLA4、HAVCR2和TIGIT）。
TRM、GZMK+CD8 T、GNLY+CD8 T、NEAT1+CD8 T和循环CD8 T细胞在鼻组织中丰富（图 D）。NPs 中 GZMK+CD8 T细胞增加，GZMB+CD8 T 细胞在血液中普遍存在，CBL和NP-BL之间没有差异（Fig 2 D, E）。
对缺乏细胞毒性T细胞特征的GZMK+CD8 T细胞进行了差异分析以进一步表征其特性（，与其他CD8 T细胞相比，GZMK和主要组织相容性复合体（MHC）II类基因在GZMK+CD8 T细胞中显著上调Fig 2 F），GSEA富集显示，IFNγ信号传导和MHC II抗原呈递相关的通路显着富集，表明它们的激活状态（Fig 2 G）。与NP来源的CD8 T细胞相比，表现出CD74和CD27水平升高（Fig 2 H），以及与细胞因子-细胞因子受体相互作用和MAPK信号通路以及EB病毒（EBV）感染相关的基因表达（Fig 2 I）。
Fig. 2: GZMK+CD8+ T cells are preferentially increased in NPs with a distinct transcriptional program.
3.GZMK+CD8 T细胞是NP中GZMK的主要细胞来源
表达量分析显示，γδT、NK和CD4 T细胞也表达GZMK，但CD8 T细胞占CD45淋巴细胞中表达GZMK的细胞的72.8%（Fig 3 A, B）；在CD8 T细胞中，与其他表达GZMK的CD8 T细胞亚型（如，GNLYCD8、MAIT和CD8 Tpex）相比，GZMK+CD8 T细胞中GZMK的表达水平更高（Fig 3 C, D）。在NP中，GZMK+CD8 T细胞占GZMK表达亚群的77.9%（Fig 3 E）。
通过流式细胞术验证了NP中CD8 T细胞产生GZMK偏斜的发现（Fig 3 F）。
造成这一现象的原因是：NP中GZMK+GZMB-CD8 T细胞的比例增加，GZMK-GZMB+CD8 T细胞的比例降低，导致NP中GZMK+GZMB-CD8 T细胞与GZMK-GZMB+CD8 T细胞的比例更高（Fig 3 G）。
与GZMB+CD8 T细胞相比，GZMK+CD8 T细胞表达高水平的趋化因子受体（CXCR3和CXCR4）、程序性细胞死亡标志物（PDCD1和PDCD4）、转录因子EOMES和低水平的ZEB2和TBX21（Fig 3 H）；通过流式细胞术进行了验证（Fig 3 I, J）。
免疫荧光染色揭示了GZMK+CD8 T和GZMB+CD8 T细胞在鼻组织固有层中的定位，并证实了与CIT相比，NP中GZMKCD8 T细胞的富集和GZMBCD8 T细胞的缺乏（Fig 3 K-N）。
Fig. 3: GZMK+CD8+ T cells are the primary cellular source of GZMK in nasal polyps.
4.NP 中 GZMKCD8 T 细胞和成纤维细胞之间的串扰
与对照参与者的正常窦粘膜相比，CD8T_GZMK细胞在E-NPs和NE-NPs中富集（Fig 4 A, B）；分析CD8T_GZMK细胞和结构细胞之间的趋化因子受体-配体相互作用，发现CD8T_GZMK仅通过CXCR4-CXCL12轴与成纤维细胞和内皮细胞相互作用，表达分析显示成纤维细胞是NP中CXCL12的主要细胞来源（Fig 4 C）。
基于空间特征、无偏聚类分析和典型基因表达，将代表性样本NP9中的spot划分为11个聚类（Fig 4 E, F），并通过单细胞数据进行反卷积，发现GZMK+CD8+ T细胞特征评分高的斑点主要分布在固有层内（Fig 4 G）。Squidpy的邻域富集分析显示GZMK+CD8 T细胞和成纤维细胞之间存在正共富集，这意味着GZMK+CD8 T细胞和NP中的成纤维细胞在物理上非常接近（Fig 4 H）。
根据特征评分富集模式，将GZMK+CD8 T/成纤维细胞共定位点定义为intra-spots，GZMK+CD8 T/成纤维细胞包围的点定义为inter-spots（Fig 4 I-L）；与远离GZMK+CD8 T细胞的成纤维细胞斑点相比，GZMK+CD8 T细胞附近成纤维细胞斑点的GZMK+CD8 T细胞特征评分升高，进一步支持了NP内成纤维细胞GZMK+CD8 T细胞之间的空间关系（Fig 4 M）；同时，空间配体受体分析也强调GZMK+CD8 T细胞和成纤维细胞之间通过CXCR4-CXCL12轴的相互作用（Fig 4 N）。
Fig. 4: Interaction and co-localization of GZMK+CD8+ T cells and fibroblasts in NPs revealed by ligand-receptor analysis and spatial transcriptomics (Visium).
由于Visium平台无法实现单细胞分辨率（包含 1-10 个细胞的 55 μm 斑点），研究人员进一步应用Visium HD平台（10x Genomics，“Visium HD”）来分析另外4个对照样品和6个NP样品（Fig 5 A），在NP固有层中鉴定并可视化了CD8T_GZMK和CD8T_GZMB细胞（Fig 5 B-E）。
NP组中观察到大量的免疫细胞浸润，巨噬细胞、浆细胞、B 细胞和CD4 T细胞比NPs中的CD8T_GZMK细胞更丰富（Fig 5 F, G）；与CIT组相比，NP中CD8T_GZMK、B 细胞和CD4 T细胞的比例增加（Fig 5 H, I），未观察到成纤维细胞或上皮细胞比例的显着变化，但观察到平滑肌细胞比例显着降低（Fig 5 J）。
与Visium的结果一致，Squidpy对Visium HD数据进行邻域富集分析后，确定了CD8T_GZMK和成纤维细胞之间的正邻域富集（Fig 5 K），配体受体分析揭示了GZMKCD8 T细胞和成纤维细胞之间通过CXCR4-CXCL12轴的细胞通讯（Fig 5 L）。
Fig. 5: Spatial proximity between GZMK+CD8+ T cells and fibroblasts revealed by Visium HD.
5.GZMK+CD8 T细胞促进成纤维细胞的促炎表型，并与NP中的中性粒细胞炎症有关
多色荧光免疫染色验证了GZMK+CD8T细胞与NP中成纤维细胞之间的空间接近（Fig 6 A）；
通过HALO软件计算成纤维细胞与GZMK+CD8 T、GZMB+CD8 T细胞、CD4 T细胞或CD19 B细胞之间的距离（Fig 6 B）。结果显示：在CIT和NP中，GZMK+CD8 T细胞25 μm半径内的成纤维细胞平均数量超过了GZMBCD8 T细胞、CD4 T细胞和CD19 B细胞25 μm半径内的平均成纤维细胞数量（Fig 6 C）。此外，GZMK+CD8 T细胞与成纤维细胞的平均最近邻距离短于NP中的GZMB+CD8 T 细胞、CD4 T细胞和CD19 B细胞（Fig 6 D）。
鉴于GZMK+CD8 T细胞的毒力降低及其与成纤维细胞的空间关系，RNA-Seq 分析显示，重组GZMK上调了NP来源的成纤维细胞中许多基因的表达，GSEA分析显示TNF信号传导、IL-1家族信号传导和白细胞迁移途径的富集（Fig 6 E-F）。体外细胞实验证实了GZMK刺激后NP来源的成纤维细胞中CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL6、CXCL8、IL6、CSF2和NFKBIZ的上调（Fig 6 G），GZMA和GZMB刺激时未观察到这种效果；CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL6、CXCL8、IL-6和CSF2的蛋白水平也显著上调（Fig 6 H）。
此外，NP中这些因子的表达也受到CD8 T细胞上清的刺激上调，而CD4 T细胞上清无影响（Fig 6 I）。
在与NP来源的成纤维细胞共培养中，GZMKCD8 T细胞的迁移增强，并且这种作用被CXCL12中性配体LIT927抑制（Fig 6 J）。
与无鼻息肉的慢性鼻窦炎（CRSsNP）患者和对照参与者的鼻组织相比，NP成纤维细胞中IL6、CXCL1、CXCL2和CXCL8表达水平显着上调（Fig 6 K）。此外，通过免疫荧光染色，在NP中检测到MPO中性粒细胞的数量增加（Fig 6 L, M）。此外，GZMK+CD8 T细胞的数量与NP中中性粒细胞的数量呈正相关，而不与嗜酸性粒细胞呈正相关（Fig 6 N, O）。
Fig. 6: Interaction between GZMK+CD8+ T cells and fibroblasts contributes to neutrophilic inflammation in nasal polyps.
6.CD8 T细胞的克隆关系和发育轨迹
通过scTCR-seq分析CD8 T细胞的克隆关系，鼻组织样本中的克隆扩增比外周血样本更明显（Fig 7 A），CIT和NP的TCR克隆型多样性显着降低（Fig 7 B）。CD8 TRM、GZMBCD8 T细胞和GZMKCD8 T细胞在CIT和NP中均表现出高水平的克隆扩增（Fig 7 C-E）。在与GZMK+CD8 T细胞相关的前100种克隆型的细胞分布中，约有20%仅在GZMK+CD8 T细胞中显示扩增（Fig 7 D）；STARTRAC转换分析强调了GZMK+CD8 T细胞和CD8 TRM细胞以及GZMB+CD8 T亚群之间存在相当大的关联（Fig 7 E）。
通过monocle 3分析CD8 T细胞的发育轨迹，并确定3条路径，.每条路径从CD8 Naive T细胞开始，然后是CD8 TRM细胞，路径1：以CD8 MAIT细胞结束；路径2：以GZMK+CD8 T细胞终止，路径3：与GZMB+CD8 T细胞连接，最终以GNLY+CD8 T细胞结束（Fig 7 F, G）。
将CD8 TRM、GZMKCD8 T细胞和GZMBCD8 T细胞的前10个最丰富的β链CDR3氨基酸序列输入到TCRmatch中，计算与免疫表位数据库（IEDB）中的序列的相似性，并检索IEDB中注释的相似TCR序列和相应的表位和抗原，几个EBV表位与NP中GZMK+CD8 T细胞的 CDR3序列匹配（Fig 7 H），没有表位与CIT中GZMKCD8 T细胞的CDR3序列匹配。
Fig. 7: Clonal relationships and developmental trajectory of CD8+ T cells.
7.慢性炎症中GZMK+CD8 T细胞的扩增和通过CXCR4-CXCL12轴与成纤维细胞的相互作用
为了验证NP中由GZMK和GZMB的非重叠表达揭示的细胞毒性CD8 T细胞的异质性，这一现象是否为炎症的普遍现象，研究人员从2型炎症性疾病（特应性皮炎、过敏性哮喘和嗜酸性粒细胞性食管炎）、非2型慢性炎症性疾病（慢性阻塞性肺病和膀胱炎）、自身免疫性疾病（皮肤红斑狼疮和甲状腺炎）和传染病（败血症和乙型肝炎病毒 [HBV] 感染）的scRNA-seq数据集中整合了108,969个CD8 T细胞（Fig 8 A）。
在整合数据集中观察到GZMK和GZMB的非重叠表达，GZMK+GZMB+CD8 T细胞仅包含一小部分CD8 T细胞（Fig 8 B-D）。在许多患有慢性炎症的组织样本中，GZMK+CD8 T细胞比GZMB+CD8 T细胞更丰富（Fig 8 E）。
对嗜酸性粒细胞性食管炎（GSE175930）和红斑狼疮（GSE179633）的真皮单细胞数据进行相互作用分析，在两种疾病状态下，GZMK+CD8 T细胞通过CXCR4-CXCL12轴与成纤维细胞相互作用（Fig 8 F-I）。
对特应性皮炎（GSE197023）的空间转录组数据分析，GZMK+CD8 T 细胞，显示出与病变皮肤中成纤维细胞的空间接近（Fig 8 J-M），以及CXCR4-CXCL12参与GZMK+CD8 T细胞和成纤维细胞的相互作用（Fig 8 N）。
Fig. 8: The expansion of GZMK+CD8+ T cells in chronic inflammatory diseases and interaction with fibroblasts via CXCR4-CXCL12 axis.
04
研究总结
使用单细胞分析、空间转录组学和TCR-seq，研究人员确定了NP中颗粒酶K（GZMK）+CD8 T细胞的存在增加，其表型与细胞毒性GZMB+CD8 T亚群不同。
空间转录组学揭示了GZMK+CD8 T细胞与成纤维是细胞的空间邻近，Visium HD数据也表明了这一点。
相互作用分析发现，GZMK+CD8 T细胞表达CXCR4并与分泌CXCL12的成纤维细胞相互作用，诱导后者以GZMK介导的独特方式产生中性粒细胞趋化因子，而不是其他颗粒酶介导。这种GZMK+CD8 T细胞-成纤维细胞的串扰也在其他炎症性疾病中观察到；scTCR-seq分析，显示了GZMK+CD8 T细胞表现出识别EB病毒的克隆的选择性扩增。
局限性：
1、本研究采用CD45分选的淋巴细胞通过10x Genomics进行单细胞测序，并未涵盖所有免疫细胞；
2、需要未来的研究来识别与GZMK+CD8 T细胞相关的表面标志物，将有助于在功能测定中分离和检查该特定群体。
3、NP中的中性粒细胞极有可能被GZMK+CD8 T细胞和成纤维细胞之间串扰之外的机制募集和激活。需要体内实验进一步研究。
4、EB病毒感染与NP中GZMK+CD8 T细胞扩增之间的关系需要进一步探索。
5、scRNA-seq 的样本量相对较小，无法深入研究患者在GZMK+CD8 T细胞含量和表型方面的异质性。
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