大家好！
您是否想针对一个很重要很有研究价值的靶点蛋白开发一款抑制剂或降解剂出来？
您关注的靶点蛋白是否结构表面光滑，缺乏结合小分子的疏水性或特异性口袋？
您关注的靶点蛋白是否是多通路中的节点蛋白，现有的小分子药物的药效有限，仅能抑制部分功能？
您的靶点蛋白是否具有高度变异性，治疗过程中非常容易产生耐药性？
您的小分子是否药效有效持续时间短，所需剂量大，副作用大？
所有的这些问题，都可以考虑用今天介绍的这款明星技术加以解决，它可以为您的成功提供可靠有效的保障。这个技术就是蛋白降解靶向嵌合体(Proteolysis-Targeting Chimera，PROTAC)技术。它是一种利用细胞内的泛素-蛋白酶体蛋白降解机制实现靶蛋白降解的新型药物设计策略。
PROTAC包含三个组件：
靶蛋白（POI）配体部分，用于特异性识别并结合POI；
E3连接酶（E3 Ligase）配体部分，用于特异性识别并结合E3 连接酶；
连接子（Linker），用于将POI配体和E3酶配体相连。
图1、PROTAC分子结构与POI-PROTAC-E3 Ligase三元复合物
PROTAC降解靶蛋白的过程通常需要有泛素(ubiquitin,Ub)、泛素激活酶 E1( ubiquitin-activating enzyme，E1)、泛素载体蛋白（ubiquitin-carrier protein，E2）、泛素连接酶（ubiquitin-ligating enzyme，E3）以及26S蛋白酶体（26S proteasomes）等物质的参与。游离的Ub分子在ATP作用下通过硫酯键与E1连接形成E1-Ub复合物。随后这些Ub会通过硫酯交换反应转移到E2的活性半胱氨酸残基上。接着E2-Ub复合物会与E3发生紧密的相互作用形成E3-E2-Ub复合物。这样的E3-E2-Ub复合物会给与它相互作用的蛋白打上泛素化标签，这些带有泛素化标签的蛋白会被26S蛋白酶体识别并降解。如果有PROTAC分子参与其中，PROTAC一端结合靶蛋白，另一端与E3连接酶相连，形成三元复合物。这样就会给靶蛋白打上泛素化的标签，使这些靶蛋白被26S蛋白酶体识别并降解。
图2、PROTAC技术的作用机制
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PROTAC的技术优势
1.降解“难成药”靶点
文章的开头，我们提到了一些传统小分子药物难以解决的问题。其中就包括“难成药”靶点蛋白。在人类疾病相关的蛋白靶点中约15%为相对容易成药的靶点，它们具有合适的结合位点和明确的活性位点，而剩下的85%为“难成药”的靶点。这些靶点通常有以下问题：
a.这些蛋白的表面较为光滑和平坦，缺少明确的配体结合口袋。这就使得可供小分子结合的位点难以被发现，大大增加了传统药物的开发难度。
b.有些靶蛋白内源性底物亲和力过高，限制了传统小分子药物的开发策略。
以RAS蛋白为例，RAS 是人类癌症中最常发生突变的癌基因；RAS 存在三种不同的亚型 (KRAS、HRAS 和 NRAS) ，它们具有高度的序列同源性。RAS 蛋白本身具有GTP酶催化活性，在非活性 (GDP 结合) 和活性 (GTP 结合) 形式之间循环。当与 GTP 结合时，它被“打开”并激活细胞内信号通路，导致肿瘤发生。RAS上承来自EGFR等细胞表面受体的信号，下启 PI3K、 RAF 等多个信号通路，起到枢纽的作用。由于缺乏明确的结合口袋且内源性底物GTP亲和力很高，相关的小分子抑制剂开发过程不可避免地受到了影响。
图3、RAS蛋白“难成药”的原因
PROTAC与传统小分子药物不同，无需和靶蛋白具有高亲和力，也无需持续占据靶蛋白的活性位点。因此PROTAC 可以在针对靶蛋白的活性口袋进行设计，通过蛋白酶体介导的降解完全抑制靶蛋白的生物学功能。例如2020 年，Crews等人针对KRAS G12C 开发的PROTAC[ACS Cent. Sci. 2020, 6, 8, 1367–1375]，通过将抑制剂MRTX849 与 VHL 配体连接，设计并合成了一系列 KRAS G12C PROTAC。经过降解活性筛选后，他们确定了一种最有效的 PROTAC分子LC-2，它可以快速诱导 KRAS G12C蛋白的降解。
图4、针对KRAS G12C 的PROTAC分子 LC-2
STAT3是STAT家族中最重要的成员之一，它在细胞的增殖、存活、分化、血管生成、免疫调节等多种生物学过程中发挥重要作用。然而，多种人类癌症愈后的不良反应，都与STAT3被持续或过度激活有关。STAT3依赖于SH2结构域之间相互作用形成的二聚化对随后靶标基因的转录激活非常关键。因此，科学家们一直以来都希望找到能作用于SH2结构域的小分子药物，从而能够阻止STAT3二聚化带来的转录活性。但SH2结构域在STAT家族中非常保守，很难找到STAT3特异的小分子抑制剂。为了解决这一问题，Wang等人基于STAT3 SH2结构域抑制剂和CRBN配体设计合成了针对STAT3的降解剂SD-36[J. Med. Chem. 2019, 62, 24, 11280-11300]。SD-36能显著地降解不同细胞系中的STAT3，并且对STAT家族的其他成员比如STAT1、STAT2、STAT4、STAT5A/B、STAT6等没有明显影响。
因此PROTAC作为有效的、高选择性、高效的靶蛋白降解手段，通过降解靶蛋白的机制，使得PROTAC分子无需与靶蛋白功能区结合，针对靶蛋白的识别区域可以是非活性区域，也不一定需要高亲和力，这就可以让更多的“难成药”靶点蛋白进入我们的研究视野。
图5、针对STAT3的 PROTAC分子SD-36
2.可以针对多重功能的靶点
除了“难成药”靶点外，PROTAC通过完全消除靶蛋白的方式来有效应对具有多重功能的靶点。IRAK4就是这样一种多功能靶点，IRAK4不仅具有激酶功能，同时还有着支架功能参与到多蛋白复合物myddosome 复合体的组装和信号转导中。myddosome 复合体会触发下游通路的激活，最终释放促炎细胞因子和趋化因子，这些细胞因子与多种自身免疫性疾病的发病机制有关。因此，IRAK4 是减轻 Toll 样受体 (TLR)/白细胞介素 1 受体 (IL-1R) 介导的炎症的有前景的治疗靶点。IRAK4 激酶抑制剂在临床上取得的成功有限，这可能是由于无法抑制 IRAK4 的支架功能。基于以上考虑，Weiss等人设计了一系列降解IRAK4的PROTAC分子，并从中选择出具有极高选择性、药效和临床前安全性的PROTAC分子KT-474[ J. Med. Chem. 2024, 67, 20, 18022–18037]，并将其推向临床I期。
因此，PROTAC这类靶蛋白降解剂提供了治疗多功能靶点的机会，通过降解靶蛋白可以直接消除治疗蛋白的所有活性，相对小分子抑制剂有着更好的药效。
图6、针对IRAK4的 PROTAC分子KT-474
3.克服耐药性
除了以上优点外，PROTAC发挥作用时，直接将靶蛋白降解，克服了传统小分子容易产生的靶蛋白过表达及突变等耐药性问题。耐药性的发生往往与点突变密切相关，点突变会降低抑制剂与靶蛋白的亲和力。比如前文提到的KRAS，虽然近年来针对KRAS G12C突变体的共价抑制剂获得FDA的批准上市，打破了KRAS的不可成药性，但仍有多种其它类型的突变基因能够激活KRAS的活性。G12D、G12V等突变的癌症患者无法获益于已上市的药物，这给利用小分子药物抑制多种KRAS突变体的活性带来了挑战。最近邓迪大学和勃林格殷格翰公司的科学家合作，将泛KRAS抑制剂BI-2865和E3连接酶VHL的配体偶联得到了一种能够降解多种KRAS突变体的PROTAC分子ACBI3。ACBI3高效且选择性地降解17种最常见的KRAS突变体中的13种，为治疗多种难治性的癌症提供了新选择[ Science. 2024, 385, 6715, 1338-1347]。
图6、泛KRAS降解剂ACBI3
4.剂量少、用药时间长、减少毒副作用。
传统小分子药物的研究通常集中在开发高亲和力抑制剂上，这些抑制剂通过占据蛋白的活性位点，以关闭蛋白质的功能。然而，在许多情况下，小分子抑制剂需要和靶蛋白的天然底物竞争结合，难以达到和维持有效抑制所必需的局部药物浓度。因此为了提高靶点占有率，往往需要高剂量的药物，这可能会带来很大的毒副作用。
PROTAC分子将靶蛋白和E3连接酶拉进，降解靶蛋白后，这些PRPTAC分子又可以去降解其它的靶蛋白。PROTAC 分子在细胞内可多次循环发挥作用，这样的过程相当于一种催化模式，因此只需较低的化合物浓度便可以达到很好的降解效率。
PROTAC优势这么多
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PROTAC的设计
PROTAC技术有这么多的优势，那么如何设计并高效评价PROTAC分子也就成为了该技术的重中之重。
从PROTAC的结构特点出发，其分子结构的设计需要同时考虑靶蛋白配体、E3连接酶配体以及Linker的长度和柔韧性等因素。这样的设计与优化过程需要进过大量的计算模拟和实验验证，但总体需要考虑的因素有以下几点：
1.靶蛋白及其配体的挑选
靶蛋白的挑选通常会根据实际面临的问题进行考虑。比如可以选择那些小分子抑制剂难以成药的靶点，如STAT3，c-MYC，Tau。这种选择思路的好处是原创性较高。而有些蛋白，如IRAK4，其本身是具有多功能的蛋白，对应的抑制剂只能抑制部分的功能。因此开发可以直接降解这些蛋白的PROTAC分子，可以为对应的治疗带来更好的药效。如果考虑那些具有高变异性的蛋白靶点，如EGFR、KRAS或BTK等，PROTAC技术则可以有效克服这些变异产生的耐药性。
在研PROTAC分子主要集中于约80个靶点：
细胞增殖相关: BRD4, CDK4/6, EGFR...；
凋亡与血管再生: Bcl-xL, PARP...；
免疫与炎症相关: PD-L1, STAT3...；
癌症转移相关：FAK, P38, Src...。
表1、靶蛋白的挑选策略
而对应配体的选择一般会考虑已经上市或文献报道的抑制剂，根据其构效关系进行结构上的衍生，遵循的原则就是避免破坏配体与靶蛋白的亲和力。对靶蛋白配体的筛选也不用考虑竞争性的结合，这也大大拓展了筛选的范围。此外在条件允许的情况下，尽可能的对结构进行简化也有利于未来的临床应用。
2.E3连接酶及其配体的挑选
E3连接酶在不同细胞或组织中的表达水平不同，因此在选择时一般会优先考虑它们在组织中的分布。目前已知的 E3连接酶约有 600 多种，文献报道的应用到PROTAC中的E3连接酶主要有CRBN、VHL、cIAP和MDM2。效果较好、使用频次最高的E3连接酶主要是CRBN和VHL两种，通常会作为设计时的首选。
图7、E3连接酶配体的发展趋势（Chem. Soc. Rev., 2022,51, 7066-7114）
配体的选择方面，最早E3连接酶的配体是基于多肽设计的，这样的PROTAC分子细胞膜通透性差，容易被磷酸酶水解，因此未得到广泛的应用。而基于小分子的PROTAC，随着E3连接酶配体的不断发现而得到了迅速的发展。其中CRBN配体基于免疫调节类药物沙利度胺进行设计，类药性良好，因此CRBN及其配体在PROTAC的应用中最为广泛。VHL的配体分子量更小，细胞通透性更强，也有着较多的应用案例。而其他E3连接酶配体可能存在分子量大、合成难度高、稳定性差等情况的困扰，应用范围受到了一定的限制。因此在设计PROTAC分子时，会优先考虑基于CRBN和VHL进行研究。
3.连接基团Linker的选择
连接基团的长度、组成、柔性、连接位点对PROTAC三元复合物的形成、降解能力和靶点选择性非常重要，需要通过大量的计算模拟和实验验证。常见的Linker主要有PEG链为代表的柔性链以及引入炔基结构的刚性链。这些不同的柔性和自由度影响着PROTAC分子的活性。根据作用靶点的不同，Linker的长短对其活性也有着重要的影响，通常会将Linker的长度控制在4-15个碳原子。Linker的连接方式会通过酯化、酰胺化或点击反应来构成。后续也可以基于这些较为简单反应，对E3连接酶配体、靶蛋白配体或连接基团进行调整来优化PROTAC分子。
图8、PROTAC分子的组装策略（Chem. Soc. Rev., 2022,51, 7066-7114）
文章小结
PROTAC作为一个热门领域，其作用机理为通过结合靶蛋白和E3连接酶，形成三元复合物，给靶蛋白打上泛素化的标签，泛素化的蛋白被细胞内的蛋白酶体26S识别并降解。
PROTAC 为传统小分子抑制剂难以处理的“难成药”靶点，如转录因子、核蛋白和支架蛋白等，提供了一种高效的解决方案。由于PROTAC的生效机制类似催化反应，因此只需要极低剂量即可发挥效用，这样就有着较高的安全性。PROTAC发挥作用时直接降解靶蛋白，克服了靶蛋白过表达及突变等耐药性问题。
PROTAC的开发还处于早期阶段，目前对 PROTAC 配体的选择更多是基于已知的抑制剂/激动剂，靶点也多为癌症相关蛋白，所以有很大的开发潜力。
以上介绍的PROTAC的设计、合成、后期验证
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鉴于很多人研究小分子抑制剂，小编操碎了心，最后再给大家总结一个PROTAC和小分子抑制剂优略势比较的表格，赶快保存吧。
表2、PROTAC VS 传统小分子
集思慧远可提供服务
南京集思慧远（GENEPIONEER）生物科技有限公司的业务主要为医院及医学类高校提供专业的实验方案整体设计，利用生物信息学对数据进行深入挖掘分析，并提供干湿结合实验CRO服务。对于PROTAC，我们也提供一些专业的技术服务。
靶蛋白抑制剂的药效分析
通过细胞增殖、凋亡以及小鼠模型的研究，检测靶蛋白抑制剂的药效与生物安全性。
靶蛋白降解剂靶点鉴定与选择性分析
通过Western Blot实验分析PROTAC分子对靶蛋白的降解能力，计算DC50值。结合定量蛋白质组学，使用PROTAC分子对细胞进行处理后提取蛋白进行质谱分析，验证PROTAC分子的靶点，并对脱靶蛋白情况以及E3连接酶底物的丰度的变化情况进行分析。
PROTAC开发-靶蛋白配体
选择已知的E3连接酶配体的利用AI虚拟筛选，从已知的抑制剂分子结构和活性出发，分析并与靶蛋白结合的关键特性，优化或发现全新的靶蛋白配体。结合靶蛋白抑制剂的药效、靶点鉴定与选择性分析对PROTAC分子进行整体的评价。
PROTAC开发-E3连接酶配体
从已验证并符合要求的靶蛋白配体出发，利用AI基于E3连接酶的3D结构探索配体与E3连接酶之间的相互作用。根据分析结果预测E3连接酶体表面潜在的结合位点，设计出能够精确匹配这些位点的分子结构，开发出具有具有优异亲和力和选择性的新E3连接酶PROTAC分子。并对其药效、靶点鉴定与选择性进行整体的评价。
PROTAC开发-Linker优化
基于已有的靶蛋白配体和E3连接酶配体，利用AI综合考虑形成三元复合体的优化目标，对PROTAC分子的Linker部分进行优化，实现更高效的PROTAC开发设计。
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集思的荣誉及成果：2017获国家高新技术企业，2020众创板挂牌，2021获江苏省民营科技企业称号。2024荣膺江苏省“专精特新”中小企业、栖霞高新区TOP20明星企业称号。创始人先后获“创业南京”人才计划二等奖，“中国江苏创新创业大赛”优胜奖，“南京市创新型企业家”称号等。
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